桃鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因家族鑒定與分析

張杰偉，吳 婷，任 飛，謝 華**，魏建華**

(1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100101)

桃鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因家族鑒定與分析

張杰偉1，吳 婷2*，任 飛1，謝 華1**，魏建華1**

(1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100101)

為了研究桃鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白(CBLs)基因家族在桃中如何發(fā)揮作用。利用桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)生物信息學(xué)手段，鑒定桃CBL家族基因的基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和編碼蛋白，通過(guò)序列比對(duì)進(jìn)行進(jìn)化和分類分析。結(jié)果表明，桃基因組中含有8 個(gè)CBL家族基因，分布于桃的5 條染色體上。MEME和Pfam保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，桃CBL蛋白均含有4個(gè)保守的EF結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹(shù)分析表明CBLs可分為4個(gè)亞家族。TMHMM 2.0Server分析顯示僅PpCBL1含有1個(gè)跨膜區(qū)。PlantsPFeatureScan分析顯示PpCBL2、3和5均含有1個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)。NetPhos 2. 0 Server結(jié)果顯示PpCBLs存在著大量的絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)潛在磷酸化位點(diǎn)。以上結(jié)果將為今后揭示桃CBL的功能提供重要的理論基礎(chǔ)。

鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白；桃；基因家族；進(jìn)化分析；序列特征

鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白(calcineurin B-like，CBL)是植物所特有的一類鈣信號(hào)感受器，其通過(guò)結(jié)合Ca2+被激活后以磷酸化的方式激活下游的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases, CIPKs)，激活的CIPKs 迅速通過(guò)磷酸化下游信號(hào)分子傳遞鈣離子信號(hào)[1]。研究表明：植物CBL-CIPK途徑不僅參與病原體與防御反應(yīng)、非生物逆境脅迫等過(guò)程，而且參與了營(yíng)養(yǎng)元素吸收與平衡、激素應(yīng)答等植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程[1-3]。植物CBL基因最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，目前已從玉米、楊樹(shù)、棉花、豆類、水稻等作物中成功分離[4]。植物CBL 蛋白的結(jié)構(gòu)較為保守，每個(gè)CBL 蛋白都包含4 個(gè)結(jié)合Ca2+的螺旋-環(huán)-螺旋的EF 手型(elongation factor hand) 結(jié)構(gòu)域，但不同CBL 之間EF 手型結(jié)構(gòu)域存在不同程度的變異[5]。植物中研究最早同時(shí)功能解析比較完整的應(yīng)答逆境脅迫的信號(hào)途徑是擬南芥CBL4-CIPK24-SOS1 通路，也被稱為SOS途徑[6-7]。研究表明：高鹽脅迫時(shí)，擬南芥AtCBL4 (SOS3)及AtCBL10結(jié)合Ca2+后與AtCIPK24 (SOS2)蛋白激酶形成蛋白復(fù)合體，在地上及地下部分分別調(diào)控相應(yīng)靶蛋白的表達(dá)，從而使植物能抵御高鹽脅以減少植株的傷害[8]。此外，擬南芥AtCBL4 (SOS3)還可通過(guò)介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白重排，從而提高植株對(duì)鹽脅迫的耐受[9]。最近的研究表明，CBL除典型的依賴CIPK信號(hào)途徑以外還存在不依賴CIPK的信號(hào)途徑，擬南芥AtCBL10在感受到鈣信號(hào)的變化之后，可直接與AtAKT1互作，削弱其介導(dǎo)的鉀離子內(nèi)流，同時(shí)AtCBL10可以與AtCIPK23競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合AtAKT1調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)的K+平衡[10]。桃是全球人民都喜歡的水果，截至2012 年，我國(guó)桃總面積和總產(chǎn)量約占全國(guó)果品總面積和總產(chǎn)量的8.65 %和6.63 %，在果品生產(chǎn)中居第四位。2012 年中國(guó)桃產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的57.05 %。因其是二倍體(2n=16)，并且基因組相對(duì)較小(225.7 Mb)已成為薔薇科研究中模式植物[11]。2013 年桃基因組草圖測(cè)序完成[11]，為后續(xù)通過(guò)生物信息學(xué)挖掘、鑒定和分析桃基因組奠定了相關(guān)基礎(chǔ)。本研究從桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)出發(fā)，重點(diǎn)分析桃CBL家族基因的基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和蛋白進(jìn)化關(guān)系及編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域，為克隆桃CBL基因提供有價(jià)值的信息，以期為進(jìn)一步研究PpCBL 蛋白的生物學(xué)功能奠定相關(guān)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥CBL基因及蛋白序列下載自TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org)，桃的CBL基因及蛋白序列均下載自JGI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Ppersica)。

1.2 方法

1.2.1 桃CBL家族基因基因結(jié)構(gòu)分析 對(duì)鑒定出的桃CBLs 基因根據(jù)其預(yù)測(cè)編碼區(qū)序列和基因組序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 在線進(jìn)行[12]。

1.2.2 CBL家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建及編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)分析 通過(guò)Clustal X(2.0)軟件對(duì)擬南芥、楊樹(shù)和桃的CBL蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析，將序列比對(duì)結(jié)果使用MEGA 7.0軟件，采用Neighborjoining法(Bootstrap值設(shè)為1000)生成CBL家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。應(yīng)用在線軟件MEME(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)和Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.sanger.ac.uk/search)對(duì)擬南芥和桃的CBL蛋白保守結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[13-14]。

1.2.3 桃CBL家族基因蛋白序列分析 利用在線軟件PlantsPFeatureScan(http://plantsp.genomics.purdue.edu/index.html)對(duì)PpCBL蛋白序列進(jìn)行N-豆蔻酰化位點(diǎn)分析。利用在線軟件NetPhos 2. 0 Server(http://www.cbs.dtu.dk)對(duì)PpCBL蛋白質(zhì)序列進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用在線軟件TMHMM 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)PpCBL蛋白序列進(jìn)行跨膜區(qū)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃CBL家族基因的鑒定和命名

根據(jù)擬南芥中已經(jīng)鑒別出來(lái)的10個(gè)CBL蛋白序列，分別利用phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)提供的Blast 程序中進(jìn)行BlastP，得到68個(gè)桃候選CBL基因。利用保守域在線預(yù)測(cè)軟件Pfam 和MEME進(jìn)行驗(yàn)證EF手型(PF13833、PF13499、PF13202、PF00036)結(jié)構(gòu)域的存在，初步確定了8個(gè)桃CBL基因。其中桃CBL基因分布在第1、2、3、5、6染色體上，根據(jù)其在染色體上的定位分別命名為PpCBL1-8，每個(gè)成員的基因長(zhǎng)度、氨基酸長(zhǎng)度、染色體定位、外顯子個(gè)數(shù)等詳細(xì)信息見(jiàn)表1。桃CBL基因家族成員中PpCBL1和4含有9個(gè)外顯子，其余成員均含有8個(gè)外顯子(圖1)。

表1 桃CBL家族基因的基本特征

圖1 桃CBL家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Gene structure of the peach CBL gene family

2.2 桃CBL基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

使用在線軟件Pfam和MEME對(duì)PpCBL 蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，桃CBL 蛋白包含4個(gè)保守EF手型結(jié)構(gòu)域。其中EF1 和EF2 之間有23 個(gè)氨基酸，EF2 和EF3 之間有25 個(gè)氨基酸外，EF3 和EF4 之間除PpCBL4中間有36個(gè)氨基酸外，其余的成員之間有32 個(gè)氨基酸(圖2)。

圖2 桃CBL家族基因編碼蛋白氨基酸序列的比對(duì)Fig.2 Alignment of the deduced amino acid sequences of peach CBL proteins

表2 桃基因組中CBL蛋白氨基酸相似性分析

2.3 桃CBL家族蛋白相似性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用進(jìn)化樹(shù)分析軟件MEGA 7.0 對(duì)10個(gè)擬南芥CBL和8個(gè)桃CBL全蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果顯示：這18個(gè)CBL分為4個(gè)亞家族，分別含有7、3、3和5個(gè)成員(圖3)。8個(gè)桃CBL蛋白的氨基酸序列相似性在49.76 % ～ 73.68 %，其中PpCBL4 和PpCBL6氨基酸序列的相似性最低，僅為49.76 %，亞家族II中的成員PpCBL3 和PpCBL7氨基酸序列的相似性最高達(dá)到73.68 %(表2)。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，桃PpCBL2、PpCBL3、PpCBL6、PpCBL7聚類到第Ⅰ亞家族，PpCBL5聚類到第Ⅱ亞家族；PpCBL1、4聚類到第Ⅲ亞家族；PpCBL8聚類到第Ⅳ亞家族(圖3)。

2.4 桃CBL基因家族蛋白序列分析

利用PlantsPFeatureScan對(duì)桃CBL蛋白進(jìn)行N-豆蔻酰化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：PpCBL2、3、5均含有1個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)。利用NetPhos 2. 0 Server軟件對(duì)PpCBL蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示PpCBL 存在著大量的絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)潛在磷酸化位點(diǎn)，這也是大多數(shù)Ser /Thr /Tyr 蛋白激酶所具有的特征，其中Ser位點(diǎn)為5～11個(gè)，Thr位點(diǎn)為1～4個(gè)，Tyr為點(diǎn)位0～4個(gè)，每個(gè)基因的磷酸化位點(diǎn)的數(shù)目和組成也不盡相同，最少的潛在磷酸化位點(diǎn)為6個(gè)，最多的為16個(gè)。利用TMHMM 2.0Server對(duì)PpCBL蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：PpCBL1在13～35 aa處可能存在有一個(gè)跨膜區(qū)，其余PpCBL均未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)(表3)。

圖3 擬南芥和桃的CBL蛋白進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree for Arabidopsis and peach CBL proteins

3 討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，CBL基因家族已經(jīng)在擬南芥、水稻、楊樹(shù)等中鑒定[15-16]，但桃CBL基因家族尚未鑒定。本研究鑒定桃CBL基因家族含有8個(gè)成員，根據(jù)其在染色體上的定位分別命名為PpCBL1-8。已鑒定的CBL家族成員的數(shù)量在擬南芥、水稻、梨、桃、番茄、甜瓜、大白菜、高粱和蘋果中存在差異。桃PpCBLs在基因組內(nèi)呈現(xiàn)不均勻分布，這與在其他物種中的報(bào)道相一致[4]。桃PpCBLs 編碼212～270 個(gè)氨基酸，但由于內(nèi)含子和非翻譯區(qū)差異導(dǎo)致PpCBLs 在桃基因組上的差異較大，在2.1～5.4 kb。EF手型結(jié)構(gòu)域是CBL 蛋白的典型結(jié)構(gòu)域。Kolukisaoglu等研究表明不同的CBL 蛋白的EF手型結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變異，但在所有已知的CBL蛋白中，EF手型區(qū)域的個(gè)數(shù)以及它們之間的距離是保持不變的[5]。結(jié)構(gòu)域分析表明，8個(gè)桃PpCBLs 都含有4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，其中EF3 和EF4 之間除PpCBL4中間有36個(gè)氨基酸外，其他結(jié)構(gòu)域之間的距離非常保守，研究各個(gè)EF 手型結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，除PpCBL7含有13個(gè)氨基酸外，其他EF結(jié)構(gòu)域均含有12 個(gè)氨基酸，隨著PpCBL4和PpCBL7的分離以及生物學(xué)功能的進(jìn)一步解析可能進(jìn)一步的豐富人們對(duì)植物CBL生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)。

表3 桃基因組中CBL 蛋白蛋白序列分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，桃與擬南芥CBL蛋白在個(gè)亞家族之間均有成員分布。AtCBL01、AtCBL09和PpCBL5同源關(guān)系較近，擬南芥AtCBL01 能被高鹽、干旱、低溫和傷害等非生物脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，但不受外源ABA 脅迫的影響[2]，而擬南芥AtCBL09 則能被ABA脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[17]；推測(cè)PpCBL5可能響應(yīng)高鹽、干旱、低溫等脅迫誘導(dǎo)，但其具體響應(yīng)何種脅迫還需要進(jìn)一步研究其在植物體內(nèi)功能。AtCBL10、PpCBL1和PpCBL4同源性較高，擬南芥AtCBL10 主要受鹽脅迫誘導(dǎo)，且主要集中在地上部表達(dá)[18]。據(jù)此推測(cè)PpCBL1和PpCBL4可能響應(yīng)高鹽脅迫，但各自具體的生物學(xué)功能也需要進(jìn)一步分析。

目前，植物CBLs的研究主要集中于擬南芥、水稻等少數(shù)幾種模式植物響應(yīng)高鹽、低鉀、低溫、干旱等少數(shù)的幾條途徑[19]。Cuéllar等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄VvCBL02-VvCIPK03和VvCBL01-VvCIPK04復(fù)合體通過(guò)激活其體內(nèi)向的鉀離子通道VvK1.2, 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鉀離子的積累促進(jìn)了葡萄的果實(shí)成熟[20]。擬南芥AtCBL02和AtCBL03參與調(diào)控植株生長(zhǎng)和種子大小[21]。這些結(jié)果表明植物CBLs具有促進(jìn)果實(shí)成熟和調(diào)控種子大小的作用。運(yùn)用反向遺傳學(xué)及特殊突變體圖位克隆技術(shù)，更加系統(tǒng)和深入的解析各PpCBL的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能，以期完善對(duì)植物CBL蛋白的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的理解。

4 結(jié) 論

桃基因組中鑒定出8 個(gè)CBL家族基因，分布于桃的5 條染色體上。桃PpCBLs均含有4個(gè)保守的EF結(jié)構(gòu)域，可分為4 個(gè)亞家族。PpCBLs 存在著大量的絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸潛在磷酸化位點(diǎn)；PpCBL2、3和5均含有1個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)；PpCBL1含有1個(gè)跨膜區(qū)。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Genome-wideAnalysisandIdentificationofCBLGeneFamilyinPeach(PrunuspersicaL.)

ZHANG Jie-wei1, WU Ting2*, REN Fei1, XIE Hua1 **, WEI Jian-hua1 **

(1. Beijing Key Laboratory of Agricultural Genetic Resources and Biotechnology, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China; 2. University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

To study the function of peach calcineurin B-like proteins (CBLs) in Peach，on the basis of peach genome database and bioinformatics method, we obtained peach CBL family genes structure and their positions on chromosome and duplication information. CBL proteins were classified according to their phylogenetic relationship. The results showed that 8PpCBLgenes existed in the peach genome and located on 5 chromosomes. Multiple alignment and motif display results indicated that all PpCBL proteins contain four conserved domains (elongation factor hand). TMHMM 2.0Server showed that there is only one deduced transmembrane region in PpCBL1. PlantsPFeatureScan showed that there is only one N-terminal myristoylation in PpCBL2,3 and 5. NetPhos 2. 0 Server showed that there are many potential phosphorylation sites in PpCBLs. Phylogenetic analysis revealed that the PpCBL family could be divided into four groups. These results would provide the theoretical basis for functional studies to reveal the role of peach CBL gene family.

CBL;Prunuspersica; Gene family; Phylogeny analysis; Sequence character

1001-4829(2017)3-0511-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.005

S662.1

A

2016-04-29

北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目(QNJJ2 01416)；北京市科技計(jì)劃(Z151100001015005)；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(KJCX20140202)

張杰偉(1982-)，男，副研究員，研究方向?yàn)榱帜痉肿由飳W(xué)，E-mail:jwzhang919@163.com,*為并列第一作者,吳婷(1988-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镄畔W(xué)，E-mail:wuting_work@163.com，**為通訊作者。