11周齡硝酸甘油大鼠模型表面效度研究

周會霞+章正祥+陳強+孔敏露+鄧玉+程靜+侯群+邵敏峰

[摘要] 目的 本研究旨在11周齡硝酸甘油偏頭痛模型大鼠頭痛行為學的基礎(chǔ)上結(jié)合臨床偏頭痛的頭痛癥狀學對偏頭痛大鼠模型的表面效度進行研究。 方法 根據(jù)體重及基礎(chǔ)痛閾將36只大鼠隨機分成四組，即正常組、模型組、西藥組（苯甲酸利扎曲普坦）、中藥組（川芎-天麻），每組9只。造模后，用高清攝像頭記錄大鼠行為學2 h。通過空白對照和藥物反證治療進行系統(tǒng)評價。 結(jié)果 造模后2 h內(nèi)，模型組爬籠及理毛次數(shù)少于正常組，撓頭次數(shù)多于正常組。西藥組及中藥組撓頭次數(shù)少于模型組。 結(jié)論 撓頭次數(shù)可以作為評價偏頭痛大鼠模型表面效度的核心內(nèi)容及判斷藥物療效的指標。同時發(fā)現(xiàn)，11周齡偏頭痛大鼠行為可能與人類偏頭痛癥狀更相近。

[關(guān)鍵詞] 偏頭痛；硝酸甘油；表面效度；周齡

[中圖分類號] R747.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）25-0033-04

Study on the surface validity of 11-week-old nitroglycerin rat model

ZHOU Huixia1，2 ZHANG Zhengxiang3 CHEN Qiang3 KONG Minlu4 DENG Yu1 CHENG Jing1 HOU Qun3 SHAO Minfeng1

1.No.1 School of Clinical Medicine， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China； 2.Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， No.1 School of Clinical Medicine， Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang Provincial Hospital of TCM， Hangzhou 310006， China； 3.Zhejiang Xiaoshan Hospital， Hangzhou 311202， China； 4.Hangzhou Geriatric Disease Hospital， Hangzhou 310022， China

[Abstract] Objective To study the surface validity of migraine rats on the basis of the headache behavioral science of 11-week-old nitroglycerin migraine rate model combined with the symptomatology of clinical migraine. Methods 36 rats were randomly divided into 4 groups according to body weight and basic pain threshold， namely normal group， model group， Western medicine group（Rizatriptan）， and traditional Chinese medicine group（ligusticum wallichii-gastrodia elata）， with 9 rats in each group. After modeling， the behavior of rats was recorded by high-definition camera for 2 hours. A systematic review was conducted by blank control and drug counterevidence therapy. Results Within 2 hours after modeling， the frequency of climbing cage and grooming in the model group was less than that in the normal group， and the frequency of scratching head was more than that in the normal group. The frequency of scratching head in the Western medicine group and Chinese medicine group was less than that in the model group. Conclusion Scratching head can be used as the core content of evaluating surface validity of migraine rats and the index of judging drug efficacy. At the same time， the behavior of 11-week-old migraine rats are found to be more likely to be associated with human migraine symptoms.

[Key words] Migraine； Nitroglycerin； Surface validity； Week age

偏頭痛是一種常見的慢性神經(jīng)血管性疾病，我國患病率為9.3%[1]，好發(fā)于中青年，40歲[2]達最高峰，40歲后發(fā)病率開始下降。2013年全球疾病負擔調(diào)查的研究結(jié)果表明偏頭痛為人類第三位常見疾病，按失能所致生命年損失（years of life lost to disability，YLDs）計算，偏頭痛為第六位致殘性疾病[3]。硝酸甘油模型具有操作簡單、機制單一、短時間內(nèi)可大量復制等優(yōu)點，且其行為學表現(xiàn)及病理生理變化與人類發(fā)病時的表現(xiàn)及變化相似，因此被廣泛應(yīng)用于偏頭痛相關(guān)課題的研究。本研究選用11周齡[4，5]大鼠通過視頻錄像方法對硝酸甘油大鼠模型行為學進行系統(tǒng)評價。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠36只，體重（300.81±10.84）g（浙江省實驗動物中心，許可證號SCXK（浙）20140001），浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。分籠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心。實驗時間：2015年2～5月。

1.2 藥品及試劑

苯甲酸利扎曲普坦（批號140404），湖北歐立制藥有限公司生產(chǎn)；川芎（1403158），天麻（1404046）江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；硝酸甘油注射液（批號20131223），北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；0.9%NaCl溶液（F1412033），杭州民生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。西藥組及中藥組均用超純水定容稀釋。

1.3主要儀器設(shè)備

Nanopure UV/UF綜合分析型超純水系統(tǒng)（D11931），美國BARNSTEAD公司生產(chǎn)；電子天平（CP213），奧豪斯儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；松下高清攝像機（HC-V210M），松下電器（中國）有限公司生產(chǎn)；數(shù)顯鼠光熱測痛儀（JD-A）：上海繼德教學實驗器械廠生產(chǎn)。

1.4 造模

36只健康SD雄性大鼠經(jīng)過7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)，先予兩次甩尾試驗，取均值，即基礎(chǔ)痛閾。動物按體重及基礎(chǔ)痛閾隨機分成四組：正常組、模型組、西藥組、中藥組，每組9只，組間均衡。正常組及模型組均予超純水灌胃（給藥體積：1 mL/100 g）；西藥組予苯甲酸利扎曲普坦溶液灌胃（給藥劑量：0.816 mg/kg，給藥體積：1 mL/100 g）；中藥組予川芎-天麻溶液灌胃（給藥劑量：2449 mg/kg，給藥體積：1 mL/100 g）。各組動物共灌胃7 d，每天1次。

以上四組中除正常組外，其余各組在完成第7天灌胃后0.5 h，進行硝酸甘油造模，即腹腔注射硝酸甘油（給藥劑量：10 mg/kg，給藥體積：0.2 mL/100 g），正常組予腹腔注射0.9%生理鹽水（給藥體積：0.2 mL/100 g）進行對照。第7天造模前測得所有SD大鼠體重為（360.36±13.35）g（相當于11周齡[4，5]）。

1.5 行為學觀察

注射完成后立即進行大鼠行為學觀察，并用高清攝像機進行記錄，共計2 h，統(tǒng)計造模后2 h內(nèi)各行為出現(xiàn)的次數(shù)。主要觀察以下3個行為學癥狀。①爬籠：雙前爪離地搭于桶壁上或騰空站立為爬籠。②理毛：大鼠用嘴舔舐爪子及身上的毛，或用前后爪搔抓頭面部以外區(qū)域的毛。③撓頭：大鼠使用前爪或后爪迅速搔抓頭面部，連續(xù)撓計為一次，若中間有停頓或者夾有其他動作，則計為兩次。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計數(shù)資料采用頻數(shù)表示。采用Shapiro-Wilk檢驗法進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，非正態(tài)計量資料以中位數(shù)（四分位間距）表示。方差齊性者比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用SNK法；方差不齊者比較采用非參數(shù)檢驗的Kruskal-Wallis法，其中兩兩比較采用所有成對比較（all pairwise multiple comparisons）法。各組資料均以α=0.05為顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠體重變化

干預(yù)前，各組大鼠基礎(chǔ)體重無統(tǒng)計學差異。第1天，正常組大鼠體重較模型組低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.007，P<0.01），西藥組大鼠體重較模型組高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.027，P<0.05），第2天到第6天模型組與其余各組大鼠體重相較無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。提示中、西藥對體重無明顯影響。見表1。

2.2 行為學結(jié)果

造模后2 h內(nèi)，正常組大鼠始終活動自如，模型組、西藥組、中藥組大鼠在造模后5 min左右開始出現(xiàn)活動減少及倦怠表現(xiàn)。其中模型組的爬籠及理毛次數(shù)[0（2.5），1（3.5）]明顯少于正常組[43（24），13（5.5）]，差異有統(tǒng)計學意義（P爬籠=0.000，P理毛=0.000，P<0.01），而模型組撓頭次數(shù)[1（3）]則多于正常組[0（0）]，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.002，P<0.01），表明造模成功。西藥組及中藥組撓頭次數(shù)[0（0.5），0（0.5）]少于模型組[1（3）]，差異均有統(tǒng)計學意義（P西藥組=0.042，P中藥組=0.031，P<0.05），表明西藥與中藥均有一定治療效果，見表2。

3 討論

偏頭痛模型廣泛應(yīng)用于偏頭痛發(fā)病機制及臨床新藥的研究，觀察指標多種多樣。目前最常用的是熱及機械痛閾值測定，用von Frey纖維絲測定足底或者面部、眶周疼痛敏感性，熱板實驗、甩尾實驗、Hargreaves測定法[6]等測定熱敏感性。但由于痛覺超敏延遲發(fā)生[6]，Tassorelli C等[7]研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油在給藥后2～4 h誘導痛覺過敏，所以測量時效性及準確性難以把握。而且雖然有近2/3偏頭痛患者有異常性疼痛[8]，但異常性疼痛不是偏頭痛的診斷標準。Jones MG[9]等通過肌電圖定量測定響應(yīng)于角膜空氣氣泡引起的眼輪匝肌眨眼反射的強度，間接記錄硝酸甘油引起的三叉神經(jīng)通路的激活。另外還有大鼠面部痛苦表情量表（RGS）測定面部動作[10]、光暗盒或者高架十字迷宮等測定畏光行為。但這些特征表現(xiàn)只存在于偏頭痛部分亞型。

偏頭痛的主要診斷依據(jù)是疼痛，而疼痛是一種生物感覺，是發(fā)生在清醒狀態(tài)下的、有行為反應(yīng)的感覺，所以研究偏頭痛模型與疼痛相關(guān)的表面效度更具說服力。表面效度是指動物模型中動物與人類之間現(xiàn)象學的相似性，即癥狀同源性。對于偏頭痛模型來講，表面效度就是指能夠多大程度上反映人類偏頭痛的客觀行為指標。目前判斷偏頭痛模型的行為學標準仍未統(tǒng)一，因此建立較好的表面效度至關(guān)重要，但同時又存在一定的困難，原因有：個別指標與臨床表現(xiàn)不符；判斷的個人主觀性較強；指標過于單一等。endprint

硝酸甘油作為NO的前體，通過激活血管平滑肌細胞內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶擴張血管誘發(fā)頭痛的發(fā)生，參與疼痛的激發(fā)與維持[11]。硝酸甘油模型具有操作簡單、機制單一、經(jīng)濟、短時間內(nèi)可大量復制等優(yōu)點，且其清醒時的行為學表現(xiàn)與患者臨床癥狀一致性較高，可較直觀反映疼痛的發(fā)生，故本研究選用了該造模法。

硝酸甘油偏頭痛大鼠的行為學目前主要有耳紅、爬籠、理毛、撓頭等，目前多數(shù)研究[12-15]發(fā)現(xiàn)大鼠在造模后即出現(xiàn)煩躁不安，表現(xiàn)為耳紅、爬籠、撓頭次數(shù)增多、過度理毛等，他們認為這些行為學表現(xiàn)與臨床患者煩躁不安、易激惹表現(xiàn)相似，可解釋為由焦慮情緒引起的自主活動增多。但李濤等[16]發(fā)現(xiàn)腹部皮下注射硝酸甘油的大鼠一開始表現(xiàn)自如，3～5 min后出現(xiàn)精神不振、反應(yīng)遲鈍。姜維等[17]、王克柱[18]研究發(fā)現(xiàn)偏頭痛造模后起初半小時，模型組較對照組撓頭明顯增多，爬籠無差異，隨后以活動減少、倦怠為主。這與本實驗一致。Tassorelli C[19]也認為偏頭痛大鼠在發(fā)病期間表現(xiàn)為活動減少，不進食飲水。這些表現(xiàn)則與臨床患者懶散、疲乏無力、昏昏欲睡等癥狀相符。以上兩種研究結(jié)果不一致，于是我們認為評價該模型的行為學指標仍未統(tǒng)一，有待進一步探討。

Andrews N等[20]研究發(fā)現(xiàn)損傷周圍神經(jīng)，表現(xiàn)為先天挖洞行為的明顯減少。另外有發(fā)現(xiàn)疼痛可以引起實驗動物進食減少[21]。已知中腦導水管周圍灰質(zhì)（PAG）調(diào)節(jié)疼痛的關(guān)鍵部位，Depaulis A等[22]通過藥物刺激PAG發(fā)現(xiàn)，作為對“深層次”或“不可避免的”疼痛，慢性損傷或失敗的反應(yīng)，動物通常會減少運動，變得更加孤獨，對環(huán)境的反應(yīng)減弱。與本研究模型組爬籠、理毛明顯減少相一致。也與人類偏頭痛患者表現(xiàn)的倦怠乏力相一致，且與偏頭痛診斷標準“活動后加重”相呼應(yīng)。偏頭痛的特征是嚴重的疼痛和對感覺刺激的敏感性增加，導致正常日常活動的抑制。據(jù)流行病學調(diào)查顯示，有大于50%[23]的患者需要臥床休息來治療偏頭痛發(fā)作。由此可知，抑制性行為是偏頭痛的重要特征之一，同時也是動物對疼痛的普遍反應(yīng)，并非偏頭痛所特有。

本研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油偏頭痛大鼠模型除理毛、爬籠等日常活動受抑制外，有特征性的撓頭行為的增加，且中藥組或西藥組干預(yù)后均明顯減少。這與Melo-Carrillo A和Lopez-Avila A[24]的發(fā)現(xiàn)部分相一致，他們通過刺激大鼠硬腦膜，發(fā)現(xiàn)偏頭痛大鼠休息、凍結(jié)行為、同側(cè)后爪撓頭較對照組明顯增多。但不管行為活躍或抑制，上述研究偏頭痛模型均有明顯增加的行為特征，即撓頭。該行為是對主觀疼痛感直接且客觀的反應(yīng)，與臨床患者的頭痛癥狀相符，故我們有理由認為撓頭可作為判斷模型成功的核心指標。

偏頭痛好發(fā)于中青年，40歲[2]達最高峰，40歲后發(fā)病率開始下降。從分子生物學角度闡釋，F(xiàn)an PC等[25]研究發(fā)現(xiàn)青春期大鼠和成年期大鼠有相當?shù)娜嫔窠?jīng)根頸部復合體（TCC），但三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)（TGVS）的外周反應(yīng)性比成人差，有年齡依賴性差異。故實驗大鼠年齡的選取與偏頭痛結(jié)局明顯相關(guān)。本實驗第7天造模前測得所有SD大鼠體重為（360.36±13.35）g（相當于大鼠11周齡[4，5]），目前大部分偏頭痛動物模型的研究選取的大鼠體重在200～300 g（相當于7～8周齡大鼠[4，5]）。因此部分研究表現(xiàn)為行動活躍，可能與青少年大鼠發(fā)病率低，三叉血管系統(tǒng)外周反應(yīng)差，尚構(gòu)不成典型的偏頭痛模型有關(guān)。不過目前這些只是猜測，尚需要實驗進一步論證。為了能盡量客觀地評價模型大鼠的行為學，本研究采用高清攝像機進行全程錄制，以便后期可以重復進行評價，增加行為學評價的準確性。另外，在指標的選擇上，我們考慮到行為學指標的易觀察性、可量化性等因素，最終將爬籠、理毛、撓頭作為觀察指標。結(jié)果顯示，模型組撓頭次數(shù)明顯多于正常組，與既往的研究結(jié)果均相符合，同時又是對疼痛的直接反映，因此，我們認為撓頭可作為評價偏頭痛模型行為學的核心指標之一。

[參考文獻]

[1] 于生元. 從宏觀到微觀認識頭痛[J]. 中國疼痛醫(yī)學雜志，2014，20（1）：2-4.

[2] Freitag FG. Why do migraines often decrease as we age？[J].Curr Pain Headache Rep，2013，17（10）：366.

[3] Global Burden of Disease Study 2013 Collaborators. Global，regional，and national incidence，prevalence，and years lived with disability for 301 acute and chronic diseases and injuries in 188 countries，1990-2013：A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013[J]. Lancet，2015，386（9995）：743-800.

[4] 施新猷. 醫(yī)用實驗動物學[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社，1999：388.

[5] Andreollo NA，Santos EF，Araujo MR，et al. Rat's age versus human's age：What is the relationship？[J]. Arq Bras Cir Dig，2012，25（1）：49-51.

[6] Bates EA，Nikai T，Brennan KC，et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice[J]. Cephalalgia，2010，30（2）：170-178.endprint

[7] Tassorelli C，Greco R，Wang D，et al. Nitroglycerin induces hyperalgesia in rats：A time-course study[J]. Eur J Pharmacol，2003，464（2-3）：159-162.

[8] Lipton RB，Bigal ME，Ashina S，et al. Cutaneous allodynia in the migraine population[J]. Ann Neurol，2008，63（2）：148-158.

[9] Jones MG，Andreou AP，Mcmahon SB，et al. Pharmacology of reflex blinks in the rat：A novel model for headache research[J]. J Headache Pain，2016，17（1）：96.

[10] Sufka KJ，Staszko SM，Johnson AP，et al. Clinically relevant behavioral endpoints in a recurrent nitroglycerin migraine model in rats[J]. J Headache Pain，2016，（17）：40.

[11] Olesen J. Nitric oxide-related drug targets in headache[J].Neurotherapeutics，2010，7（2）：183-190.

[12] 付先軍，宋旭霞，周永紅，等. 硝酸甘油型實驗性偏頭痛大鼠模型行為癥狀學評價[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學雜志，2005， 4（5）：449-451.

[13] 白方會，李慧，任志軍，等. 正天丸對偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X3受體表達的影響[J]. 中國病理生理雜志，2016，32（5）：923-927.

[14] Li JC，Shen XF，Meng XL，et al. Analgesic effect and mechanism of the three TCM-herbal drug-combination Tou Feng Yu pill on treatment of migraine[J]. Phytomedicine，2011，18（8-9）：788-794.

[15] Zhu X，Han Y，Xiong W，et al. Heat coagulation of middle meningeal artery affects plasma CGRP and substance P levels in migraine rat triggered by nitroglycerin[J]. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2011，25（10）：460-462，468.

[16] 李濤，曹克剛，田鶴，等. 正天丸對時相性偏頭痛動物模型行為學表現(xiàn)及血管活性物質(zhì)的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報，2010，30（12）：19-20，33.

[17] 姜維，韋華梅，趙美，等. 大鼠偏頭痛模型的制作改進及評判指標選擇[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2015，15（9）：1623-1627.

[18] 王克柱，孫軍花，徐攀，等. 硝酸甘油誘導的偏頭痛大鼠自主活動的變化[J]. 神經(jīng)藥理學報，2015，5（3）：6-11.

[19] Tassorelli C，Joseph SA. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat[J]. Brain Res，1995，682（1-2）：167-181.

[20] Andrews N，Legg E，Lisak D，et al. Spontaneous burrowing behaviour in the rat is reduced by peripheral nerve injury or inflammation associated pain[J]. Eur J Pain，2012，16（4）：485-495.

[21] Malick A，Jakubowski M，Elmquist JK，et al. A neurohistochemical blueprint for pain-induced loss of appetite[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（17）：9930-9935.

[22] Depaulis A，Keay KA，Bandler R. Quiescence and hyporeactivity evoked by activation of cell bodies in the ventrolateral midbrain periaqueductal gray of the rat[J]. Exp Brain Res，1994，99（1）：75-83.

[23] Brandes JL. Global trends in migraine care：Results from the MAZE survey[J]. CNS Drugs，2002，16（Suppl 1）：13-18.

[24] Melo-Carrillo A，Lopez-Avila A. A chronic animal model of migraine，induced by repeated meningeal nociception，characterized by a behavioral and pharmacological approach[J]. Cephalalgia，2013，33（13）：1096-1105.

[25] Fan PC，Kuo PH，Hu JW，et al. Different trigemino-vascular responsiveness between adolescent and adult rats in a migraine model[J]. Cephalalgia，2012，32（13）：979-990.endprint