姜黃素逆轉非小細胞肺癌TKI靶向藥物耐藥機制的研究

張衛平+王玨+冉冉

[摘要] 目的 探討姜黃素逆轉非小細胞肺癌（NSCLC）酪氨酸激酶抑制劑（TKI）靶向藥物耐藥的分子機制。 方法 選用非小細胞肺癌NCI-H1975細胞，分別采用相應藥物進行處理。采用MTT法檢測姜黃素對NCI-H1975細胞增殖的抑制作用，同時檢測姜黃素對NCI-H1975細胞耐藥性的逆轉作用，采用流式細胞術檢測姜黃素對NCI-H1975細胞凋亡率的影響，采用Western Blot法檢測各組NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平。 結果 與對照組比較，姜黃素5 μmol/L組、10 μmol/L組、15 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組在24 h、48 h、72 h對NCI-H1975細胞增殖抑制率明顯較高（P<0.05），并且具有劑量及時間依賴性；對NCI-H1975細胞TKI耐藥性的逆轉倍數比較，預處理+姜黃素+吉非替尼組>姜黃素+吉非替尼組>預處理+吉非替尼組（P<0.05）。與對照組比較，各組NCI-H1975細胞凋亡率較高，其中聯合用藥組>吉非替尼組>姜黃素組（P<0.05）。與對照組比較，各組NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平較低，其中聯合用藥組<吉非替尼組<姜黃素組（P<0.05）。 結論 姜黃素能有效逆轉NCI-H1975細胞TKI靶向藥物耐藥性，抑制細胞增殖并促進其凋亡，最佳給藥方式是姜黃素預處理后再與吉非替尼聯用，作用機制可能與下調p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白水平有關。

[關鍵詞] 姜黃素；非小細胞肺癌；TKI靶向藥物；耐藥機制

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）25-0037-05

Study on the resistance mechanism of curcumin in reversing TKI targeted drugs in non-small cell lung cancer

ZHANG Weiping WANG Jue RAN Ran

Department of Oncology， the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Medical Chinese University， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of curcumin in reversing the drug resistance of tyrosine kinase inhibitor（TKI） targeted drugs in non-small cell lung cancer（NSCLC）. Methods NCI-H1975 cells of NSCLC were selected and treated with corresponding drugs. MTT assay was used to detect the inhibitory effect of curcumin on the proliferation of NCI-H1975 cells. The reversal effect of curcumin on NCI-H1975 cell resistance was also detected. The effect of curcumin on the apoptosis rate of NCI-H1975 cells was detected by flow cytometry. The expression levels of p-PI3K， p-Akt， p-Ras and p-ERK proteins in NCI-H1975 cells were detected by Western Blot method. Results Compared with the control group， the cell proliferation inhibitory rate of NCI-H1975 cells was significantly higher in the curcumin 5 μmol/L group， 10 μmol/L group， 15 μmol/L group， 20 μmol/L group and 40 μmol/L group at 24 h， 48 h and 72 h（P<0.05）， showing a dose and time dependence； the reversing fold of TKI resistance of NCI-H1975 cells was compared， and pretreatment+curcumin+gefitinib group>curcumin+gefitinib group>pretreatment+gefitinib group（P<0.05）. Compared with the control group， the apoptosis rate of NCI-H1975 cells in each group was higher， and the combined drug use group>gefitinib group>curcumin group（P<0.05）. Compared with the control group， the expression levels of p-PI3K， p-Akt， p-Ras and p-ERK protein in NCI-H1975 cells in each group were lower， and the combined drug use group gefitinib group

[Key words] Curcumin； Non-small cell lung cancer； TKI targeted drugs； Resistance mechanism

肺癌是世界范圍內發病率及死亡率最高的惡性腫瘤，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）是最常見的肺癌類型，約占80%[1]。流行病學資料顯示，2012年全球有182萬新發肺癌患者，158萬患者死亡，已經成為世界性健康問題[2]。我國隨著吸煙人數增加、人口老齡化程度加深等，近年來肺癌發病率也呈現不斷上升趨勢，關于肺癌治療手段的研究也備受關注。分子靶向藥物是NSCLC治療的新手段，具有靶向性、安全性等優點[3]，其中以酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）最為常見。TKI類藥物以人表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變引起的酪氨酸激酶異常活化為作用靶點，能有效阻斷EGFR磷酸化，調節細胞凋亡相關信號通路，促進腫瘤細胞凋亡，療效確切，已經被推薦用于EGFR突變陽性患者的一線治療[4]。但有研究發現，一般治療8～11個月會有獲得性耐藥現象產生[5]，影響治療效果。姜黃素是提取自中藥姜黃的多酚類物質，具有逆轉腫瘤多藥耐藥的作用[6]，但關于其對NSCLC細胞TKI耐藥性的影響及機制的研究較少。本研究即探討姜黃素逆轉NSCLC細胞TKI靶向藥物耐藥的分子機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 人非小細胞肺癌NCI-H1975細胞株，品牌：ATCC，購自北京中原公司。

1.1.2 藥品與試劑 姜黃素，CAS號：458-37-7，純度：≥98%，品牌：克拉瑪爾，購自上海紫一試劑廠，采用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解后加雙蒸水配制成濃度為500 μmol/L的溶液，用RPMI-1640培養液稀釋至所需濃度；吉非替尼片，規格：0.25 g，國藥準字J20100014，購自英國阿斯利康制藥有限公司，采用DMSO溶解配制25 mmol/L溶液，用RPMI-1640培養液稀釋至所需濃度；磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS），購自北京奧博來科技有限責任公司；RPMI-1640培養基、0.25%胰蛋白酶消化液，購自美國GIBCO公司；胎牛血清（FBS），以色列Biological Industries公司產品；DMSO、四甲基偶氮唑藍（MTT），購自山海索萊寶生物科技有限公司；細胞培養用青霉素-鏈霉素、BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術研究所產品；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒，購自上海銘博生物科技有限公司；增強型化學發光底物（enhanced chemiluminescence substrate，ECL）檢測試劑盒，購自上海炎熙生物科技有限公司；小鼠磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）、p-Ras、磷酸化胞外信號調節的激酶（phosphorylated extracellular signal regulated kinase，p-ERK）抗體，廈門慧嘉生物科技有限公司產品；辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG，購自上海朗頓生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 細胞培養板、75 cm2細胞培養瓶，購自北京思齊生物技術有限公司；3121型CO2恒溫細胞培養箱、902-ULTS超低溫冰箱，美國Thermo Scientific Forma公司產品；DK-8D型電熱恒溫水槽，購自上海優耳儀器科技有限公司；TD5M型低速離心機，購自長沙湘智離心機儀器有限公司；K40型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司產品；680型臺式酶標儀，美國Bio-Rad公司；EPICS-XL型流式細胞儀、DC-7型紫外分光光度計，美國Beckman Coulter公司；DYY-7C型電泳儀，購自北京六一儀器廠；JS-680全自動數碼凝膠成像分析儀，購自上海培清科技有限公司；SRC20BA型高速冷凍離心機，日本HITACHI公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇及培養 取出凍存的非小細胞肺癌NCI-H1975細胞株，37℃恒溫水浴融化，之后置于培養瓶內，培養瓶中有含10%滅活FBS、100 U/mL青霉素及100 g/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養液，在5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫細胞培養箱內進行細胞培養，每3～4天進行換液傳代，待傳代至第3代，NCI-H1975細胞貼壁生長至占滿培養瓶80%時，即處于對數生長期，收集對數生長期的細胞作為實驗對象。

1.2.2 姜黃素對NCI-H1975細胞增殖的抑制作用檢測 取對數生長期NCI-H1975細胞，滴加0.25%胰蛋白酶消化液0.5 mL消化，孵育3 min后加入RPMI-1640完全培養液制備單細胞懸液，調整細胞濃度為2×105個/mL，將細胞液接種于96孔板內，每孔100 μL，分別滴加濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的姜黃素溶液200 μL，每個濃度設6個復孔，另外設置姜黃素濃度為0 μmol/L的對照組以及不含細胞的空白組，空白組加入200 μL完全培養基，于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫細胞培養箱內培養，分別孵育24 h、48 h、72 h后，滴加5 mg/mL MTT溶液20 μL/孔，培養4 h，采用高速冷凍離心機500 r/min離心10 min，棄上清，沉淀內加入100 μL DMSO溶液，振蕩10 min充分溶解，采用680型臺式酶標儀，在490 nm波長處測定各培養孔的光密度（OD值）。計算NCI-H1975細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%，并計算作用48 h后，姜黃素的半數抑制量（IC50）及IC15值。endprint

1.2.3 姜黃素對NCI-H1975細胞耐藥性的逆轉作用檢測 取對數生長期NCI-H1975細胞，滴加0.25%胰蛋白酶消化液0.5 mL消化，孵育3 min后加入RPMI-1640完全培養液制備單細胞懸液，調整細胞濃度為2×105個/mL，將細胞液接種于96孔板內，每孔100 μL，設置吉非替尼組、預處理+姜黃素+吉非替尼組、姜黃素+吉非替尼組、預處理+吉非替尼組、對照組及空白組，每組設6個復孔，吉非替尼組分別滴加0.01、0.04、0.1、0.4 μmol/L吉非替尼溶液200 μL；預處理+姜黃素+吉非替尼組首先采用100 μL 10 μmol/L姜黃素溶液預處理，孵育30 min后，分別滴加10 μmol/L姜黃素溶液100 μL及0.01、0.04、0.1、0.4 μmol/L吉非替尼溶液200 μL；姜黃素+吉非替尼組不經預處理，直接分別滴加10 μmol/L姜黃素溶液100 μL及0.01、0.04、0.1、0.4 μmol/L吉非替尼溶液200 μL；預處理+吉非替尼組采用100 μL 10 μmol/L姜黃素溶液預處理，孵育30 min后，分別滴加0.01、0.04、0.1、0.4 μmol/L吉非替尼溶液200 μL；對照組加入200 μL完全培養基；空白組不含細胞，只含200 μL完全培養基。繼續孵育24 h、48 h、72 h后，按照1.2.2的步驟，采用MTT法檢測各培養孔OD值，計算細胞增殖抑制率，并據此計算各組IC50值，根據逆轉倍數=吉非替尼組IC50/姜黃素干預組IC50，計算逆轉倍數。

1.2.4 流式細胞術（FCM）檢測NCI-H1975細胞凋亡率 取對數生長期NCI-H1975細胞，制備濃度為2×105個/mL的單細胞懸液，取6孔板，接種細胞懸液2 mL/孔，加入RPMI-1640完全培養基200 μL，于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫細胞培養箱內培養24 h，設置吉非替尼組、姜黃素組、聯合用藥組及對照組，每組設6個復孔，吉非替尼組加入0.1 μmol/L吉非替尼溶液200 μL，姜黃素組加入10 μmol/L姜黃素溶液200 μL，聯合用藥組首先采用100 μL 10 μmol/L姜黃素溶液預處理，孵育30 min后，分別滴加10 μmol/L姜黃素溶液100 μL+0.1 μmol/L吉非替尼溶液200 μL，對照組加入200 μL完全培養基，培養72 h后，加入0.25%胰蛋白酶4 mL進行消化，采用離心機1000 r/min速度離心5 min，棄上清液，PBS沖洗3次后，采用500 μL binding buffer重懸細胞，滴加異硫氰酸熒光素（FITC）標記的 Annexin V 10 μL，4℃70%乙醇5 mL進行固定；過夜后，1000 r/min速度離心5 min，棄乙醇，200 μL PBS重懸細胞，避光孵育 15 min后滴加碘化丙啶（PI）5 μL，避光孵育5 min后采用流式細胞儀檢測各組NCI-H1975細胞凋亡率。

1.2.5 Western Blot法檢測NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平 按照1.2.4中的方法培養細胞及分組干預，每組取100 mg細胞，加入組織裂解液，提取組織蛋白質，按照試劑盒說明書操作，采用BCA法測定總蛋白濃度；取20 g蛋白質樣品，采用電泳儀，通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE），將凝膠轉移到 PVDF 膜上，滴加5%脫脂奶粉，封閉90 min后，分別滴加小鼠p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK一抗（1∶1000稀釋），分子量為42 KD的β-Actin抗體（1∶400稀釋）作為內參，孵育2 h，滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgG二抗（1∶1000稀釋），孵育1 h，按照ECL檢測試劑盒說明，進行顯影、定影。采用數碼凝膠成像分析儀掃描圖像，分析電泳結果，計算p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

采用SPSS17.0統計學軟件包分析，符合正態性的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間資料比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用GraphPad Prism軟件繪制圖表。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度姜黃素對NCI-H1975細胞的增殖抑制率比較

MTT法檢測結果顯示，與對照組比較，姜黃素5 μmol/L組、10 μmol/L組、15 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組在24 h、48 h、72 h對NCI-H1975細胞增殖抑制率明顯較高，差異有統計學意義（P<0.05），并且具有劑量及時間依賴性。經計算姜黃素48 h對NCI-H1975細胞的IC50為25.1 μmol/L，IC15為10.75 μmol/L，選用10 μmol/L作為姜黃素后續實驗濃度。見表1。

2.2 姜黃素不同用藥方式對NCI-H1975細胞耐藥性的逆轉作用比較

結果顯示，姜黃素能夠明顯逆轉NCI-H1975細胞對吉非替尼的耐藥性，且逆轉倍數比較，預處理+姜黃素+吉非替尼組>姜黃素+吉非替尼組>預處理+吉非替尼組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組NCI-H1975細胞凋亡率比較

與對照組比較，吉非替尼組、姜黃素組、聯合用藥組NCI-H1975細胞凋亡率明顯較高，差異有統計學意義（P<0.05），其中聯合用藥組>吉非替尼組>姜黃素組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 各組NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平比較

與對照組比較，各組NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平明顯較低，差異有統計學意義（P<0.05），其中聯合用藥組<吉非替尼組<姜黃素組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4、封三圖6。endprint

3討論

NSCLC的發病率及死亡率近年來不斷增加，給我國造成沉重的社會負擔。目前，NSCLC治療的主要手段仍為外科手術，但是只適用于早期患者，而大部分患者在確診時已經發展至中晚期，失去手術治療時機。傳統的放療、化療等手段能一定程度延長患者生存期，但療效有限，且副作用較多。分子靶向治療是目前研究的熱點，吉非替尼等TKI類藥物是治療EGFR突變陽性NSCLC的有效靶向藥物，能顯著延長患者無疾病進展生存期[7]。但是，吉非替尼治療肺腺癌的緩解期僅為9～11個月，之后極易產生耐藥性，影響藥物療效。吉非替尼耐藥包括原發耐藥和繼發耐藥，原發耐藥可能與EGFR下游信號分子K-ras突變、抑癌基因PTEN功能喪失等機制有關[8]，繼發耐藥的產生可能與EGFR基因exon-20二次突變、MET原癌基因擴增、腫瘤微環境改變等機制有關[9-10]。逆轉吉非替尼耐藥性對于提高治療效果、改善患者預后意義重大。中藥中多酚、黃酮、生物堿等多種成分在逆轉腫瘤對化療藥物耐藥性方面具有較好作用，姜黃素是提取自中藥姜黃的多酚類活性成分，具有抗炎、抗氧化應激、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管形成等藥理作用[11-13]。此外，姜黃素還是一種有效的腫瘤多藥耐藥逆轉劑，有研究認為，姜黃素能夠通過抑制p-糖蛋白（P-gp）表達，來降低乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR對紫杉醇的耐藥性[14]；姜黃素還能通過抑制多藥耐藥相關蛋白（MRP）表達量，來提高吉西他濱對胰腺癌耐藥株BXPC-3細胞移植瘤的治療效果[15]。而目前關于姜黃素逆轉TKI耐藥性的研究較少。

本次研究選擇吉非替尼耐藥細胞株NCI-H1975細胞常規進行傳代培養，分別采用5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的姜黃素溶液進行干預，通過MTT法對各組細胞增殖抑制率進行檢測，結果顯示，與對照組比較，各濃度姜黃素在24 h、48 h、72 h對NCI-H1975細胞增殖抑制率明顯較高，且濃度越高、作用時間越長，細胞增殖抑制率越高（P<0.05），表明姜黃素對于NCI-H1975細胞增殖有良好抑制作用，并且具有劑量及時間依賴性。姜黃素不同用藥方式對NCI-H1975細胞耐藥性的逆轉作用比較結果顯示，姜黃素能夠明顯逆轉NCI-H1975細胞對吉非替尼的耐藥性，且逆轉倍數比較，預處理+姜黃素+吉非替尼組>姜黃素+吉非替尼組>預處理+吉非替尼組（P<0.05），表明經姜黃素預處理后，再給予姜黃素聯合吉非替尼的用藥方式能取得最好的逆轉效果。表3檢測結果顯示，與對照組比較，吉非替尼組、姜黃素組、聯合用藥組NCI-H1975細胞凋亡率明顯較高，且聯合用藥組>吉非替尼組>姜黃素組（P<0.05），表明姜黃素具有促進NCI-H1975細胞凋亡的作用，與吉非替尼聯合使用促凋亡作用更強，二種藥物具有協同作用。

TKI靶向藥物是EGFR抑制劑，EGFR在許多NSCLC細胞中過高表達，主要通過PI3K-Akt和Ras-Raf-MEK-ERK兩條下游信號通路來誘導腫瘤細胞增殖、侵襲、血管生成、腫瘤轉移等，TKI類藥物則可抑制信號通路信號轉導，誘導細胞阻滯，加速細胞凋亡，起到抗腫瘤作用[16-18]。TKI的耐藥性也與EGFR下游通路信號轉導子的改變密切相關[19]。PI3K-Akt的信號轉導子主要包括PI3K、磷脂酰肌醇依賴性激酶（PDK）、Akt等，在腫瘤血管形成和轉移中起重要作用；Ras-Raf-MEK-ERK通路則主要包含細胞膜小分子蛋白Ras、Raf激酶、絲裂原活化的細胞外信號調節激酶（MEK）、ERK等，主要參與細胞增殖及凋亡相關基因轉錄的調節過程[20]。信號通路中相關蛋白分子的磷酸化水平與該信號通路的活化程度正相關。本研究結果顯示，與對照組比較，各組NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平明顯較低，其中聯合用藥組<吉非替尼組<姜黃素組（P<0.05），表明姜黃素聯合吉非替尼能夠下調NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白水平，抑制PI3K-Akt和Ras-Raf-MEK-ERK通路磷酸化水平，這可能是姜黃素逆轉NCI-H1975細胞TKI耐藥性的機制。

綜上所述，姜黃素能有效逆轉NCI-H1975細胞TKI靶向藥物耐藥性，抑制細胞增殖并促進其凋亡，最佳給藥方式是姜黃素預處理后再與吉非替尼聯用，作用機制可能與下調p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白水平有關。

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