3種牙齒DNA提取方法的比較

黃華春+曾緒東+孫長(zhǎng)勇

【摘要】 目的 比較3種方法提取牙齒DNA的效果。方法 20具尸體的20顆磨牙， 將每顆牙磨成粉共60份， 分成A組、B組及C組， 每組20份。分別用M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法對(duì)牙齒DNA進(jìn)行提取， 比較3種方法提取牙齒DNA濃度水平、陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照（IPC）熒光域值循環(huán)數(shù)（CT值）和短片段重復(fù)序列（STR）分型結(jié)果。結(jié)果 用M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法提取牙齒DNA濃度水平分別為（5.24±2.81）、（5.66±2.33）、（8.23±3.54）ng/μl， AutoMate Express純化法高于其他兩種方法， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；上述3種方法提取牙齒DNA的IPC CT值分別為（27.16±0.28）、（26.96±0.36）、（27.12±0.22）， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法3種方法STR基因座檢出分型成功率分別為95%、95%和100%。結(jié)論 AutoMate Express純化法對(duì)牙齒DNA的提取效果優(yōu)于M48純化法、QIAcube純化法。

【關(guān)鍵詞】 牙齒；M48純化法；QIAcube純化法；AutoMate Express純化法

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.27.046

牙齒是DNA檢驗(yàn)中的常見(jiàn)檢材， 但牙齒的DNA提取是DNA檢驗(yàn)的一大難點(diǎn)。牙齒DNA提取的研究已有不少文獻(xiàn)報(bào)道[1-3]。本文通過(guò)比較M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法提取牙齒DNA的效果， 以供同行參考。

1 材料與方法

1. 1 材料 牙齒樣本來(lái)自實(shí)驗(yàn)室2015年4月～2016年11月

受理的檢材。每具尸體1顆磨牙， 共20顆磨牙， 用刀片刮凈牙齒表面， 浸泡在5%次氯酸鈉溶液中5 min， 再用蒸餾水泡洗3次， 紫外燈照射6 h[4]。將每顆牙磨成粉， 稱取200 mg為1份， 共3份， 分為A、B、C三組， 置于3個(gè)1.5 ml離心管， 60份牙粉分別標(biāo)記為A1、A2……A20；B1、B2……B20；C1、C2……C20。同時(shí)提取尸體的肋軟骨作為對(duì)照物。

1. 2 方法

1. 2. 1 DNA提取

1. 2. 1. 1 M48純化法 A組牙粉加入MagAttract DNA Mini M48 Kit試劑盒G2 250 μl、蛋白酶（P）K（20 mg/ml）20 μl及二硫蘇糖醇（DTT）（1 mol/L）20 μl， 56℃裂解6 h， 離心后加入MTL 750 μl及30 μl硅珠， 吸附15 min后棄液體， 80%乙醇洗滌3次， 置65℃烘干， 洗脫體積50 μl。

1. 2. 1. 2 QIAcube純化法 B組牙粉加入QIAamp DNA Investigator試劑盒ATL 300 μl、PK（20 mg/m1）20 μl及DTT （1 mol/L） 20 μl， 56℃裂解6 h后置QIAcube核酸純化儀提取DNA， 洗脫體積50 μl。

1. 2. 1. 3 AutoMate Express純化法 C組牙粉加入PrepFiler Express BTA DNA試劑盒的裂解液300 μl、PK（20 mg/ml）

20 μl及DTT （1 mol/L） 20 μl， 56℃裂解6 h后置AutoMate Express DNA提取系統(tǒng)提取DNA， 洗脫體積50 μl。

1. 2. 2 DNA定量 采用Quantifiler Human DNA Quantification試劑盒， 用ABI 7500定量PCR儀對(duì)提取的樣本DNA濃度進(jìn)行定量， 按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1. 2. 3 PCR擴(kuò)增與檢測(cè) 采用Identifiler plus試劑盒進(jìn)行復(fù)核擴(kuò)增， 反應(yīng)體系10 μl， 模板DNA 1 μl， 循環(huán)29次， 擴(kuò)增產(chǎn)物用3130XL遺傳分析儀檢測(cè)， GeneMapper ID 3.2分析， 相對(duì)熒光單位（RFU）的閾值為50， 以獲得性別及12個(gè)以上STR基因座明確分型判為成功分型[5]。

1. 3 觀察指標(biāo) 觀察3種方法提取DNA濃度水平、IPC CT值及STR基因座檢出分型成功情況。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 多組間比較采用ANOVA方差分析， 兩兩比較采用LSD法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 3種方法提取牙齒的DNA濃度水平和IPC CT值比較 采用AutoMate Express純化法提取的牙齒DNA濃度水平高于M48純化法、QIAcube純化法， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；QIAcube純化法與M48純化法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。采用上述3種方法提取牙齒的IPC CT值均在

27左右， QIAcube純化法的IPC CT值最低， 但3種方法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P>0.05）。見(jiàn)表1。

2. 2 3種方法STR基因座檢出分型成功率 3種方法提取牙齒DNA擴(kuò)增后檢測(cè)， 與肋軟骨檢出的DNA分型進(jìn)行比較， AutoMate Express純化法提取牙齒的分型成功率為100%， M48純化法和QIAcube純化法均為95%。見(jiàn)表2。

3 討論

目前， 牙齒DNA的提取方法有很多， M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法是常用的牙齒DNA提取方法， 3種方法提取DNA的原理有所不同。M48純化法是一種硅珠法， 在高鹽濃度下DNA特異性吸附到二氧化硅上。QIAcube純化法是一種硅膜法， 離心柱上硅膠膜能特異性結(jié)合DNA。AutoMate Express純化法是一種磁珠法， 在高濃度鹽的條件下， 磁珠能特異性吸附DNA。endprint

本文通過(guò)對(duì)牙齒樣本用M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法提取牙齒DNA， 結(jié)果表明， AutoMate Express純化法獲得的DNA濃度水平最高， 顯著高于另外2種方法。本研究檢出的牙齒DNA濃度水平比其他的研究者[1-3]

檢出的都明顯增高， 究其原因應(yīng)該是所檢牙齒都是在死后

2個(gè)月內(nèi)尸體上提取的， 牙齒較為新鮮， 牙齒質(zhì)量好。3種方法提取的牙齒DNA相同條件擴(kuò)增和檢測(cè)后顯示， AutoMate Express純化法的STR分型成功率達(dá)到了100%， 高于M48純化法、QIAcube純化法。從牙齒DNA濃度水平和STR分型成功率比較， AutoMate Express純化法對(duì)牙齒DNA的提取效果優(yōu)于M48純化法、QIAcube純化法， 原因可能是PrepFiler Express BTA DNA試劑盒的磁珠是一種納米級(jí)磁珠， 平均粒徑小， 分散性好， 不容易聚團(tuán)和貼壁， 單位體積中的磁珠具有更大的用于吸附DNA的表面積， 吸附DNA能力更強(qiáng)[6]。

Quantifiler Human DNA Quantification試劑盒中， IPC與模板DNA同步擴(kuò)增， 熒光定量PCR技術(shù)能判斷模板中是否存在影響PCR的抑制物， IPC CT值的高低能夠反映抑制物量的多少[7-10]。本研究結(jié)果顯示， 3種方法提取牙齒DNA模板的抑制物均較少， IPC CT值均在27左右， 其中QIAcube純化法的IPC CT值最低， 但3種方法間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。QIAcube純化法在清除抑制物的能力稍優(yōu)于另外

2種方法， 分析其原因可能是與硅膠模有關(guān)， 硅膠模的孔徑能有效的濾去大顆粒雜質(zhì)、小片段DNA和其他抑制成分。

綜上所述， M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法中的AutoMate Express純化法提取牙齒DNA效果最好， 提取牙齒DNA能免脫鈣， 裂解時(shí)間短， 又能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化提取， 在實(shí)際檢案中可以作為優(yōu)選方案。

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[收稿日期：2017-04-20]endprint