發酵法生產十二碳二元酸的高效菌株復合篩選的研究

姚嘉旻 盧利玲

【摘要】選取現有保藏菌株作為實驗出發菌株，利用兩步濃縮法篩選α，ω?氧化性強、β?氧化性弱的酵母菌優勢菌株。經發酵罐驗證，發酵155h產酸約180克/升，達到了篩選產酸水平高、烷烴轉化率高的優勢菌株的目的，增加二元酸項目的競爭力及應變能力。

【關鍵詞】十二碳二元酸；復合誘變；顯色篩選

本課題針對長鏈二元酸工藝的研究進展及其現狀，通過系列誘變篩選來挑選出烷烴轉化率高、發酵周期短、產酸性能更強的優勢菌株，為發酵法生產長鏈二元酸高效菌株的篩選提供依據。

一、材料與方法

（一）材料

1.出發菌種：經初步產酸評價后，初步確定6株保藏菌株作為誘變育種出發菌株。

2.試劑

糖蜜，尿素，酵母膏，均為工業級。

3.培養基

（1）篩選培養基：在種子培養基成分。（2）基礎上有所改變，如下：蔗糖碳源培養基、烷烴碳源培養基；顯色培養基。（3）發酵培養基：成分與種子培養基一致，烷烴量根據實際要求足量添加。

（二）方法

1.分析方法

（1）產酸量。搖瓶發酵、破乳抽提，用標準氫氧化鈉溶液標定二元酸產酸含量。（2）二元酸成分同。（3）提純長鏈二元酸產品，干燥后經氣相色譜分析測定二元酸成分。

2.初篩程序

出發菌株→篩選培養基（初篩A）→產酸顯色培養基（初篩B）→初篩菌株→初篩產酸驗證。

3.復篩程序

初篩菌株→物理化學誘變→產酸顯色培養基（復篩A）→秋水仙堿產酸培養基→鉻酸鉀產酸培養基（復篩濃縮B）→復篩優勢菌株。

二、結果與討論

（一）復篩實驗結果

1.紫外誘變

圖1分析，熱帶假絲酵母菌的紫外誘變致死率與照射時間呈正相關性；同時，紫外誘變的正突變率隨照射時間的延長呈先增長而后降低的變化趨勢，選擇紫外誘變照射時間為150秒較適宜，其對應致死率及正突變率分別為88%、40%.

2.超聲波誘變

誘變時長為12min時，對應致死率及正突變率分別為94%、45%，而誘變時長為15min時，對應致死率及正突變率分別為99%、48%，選擇誘變時間為12min更為適宜。再經兩步濃縮法獲得誘變正突變菌株56株。

（三）產酸驗證

1.搖瓶產酸驗證

出發菌株QJ-EY09初始產酸水平僅為75g/L，經復合誘變篩選流程，突變菌株最高產酸水平約185g/L，產酸水平是出發菌株的2.4倍。

2.發酵罐產酸驗證

選擇搖瓶產酸對應烷烴轉化率較高的誘變菌株，經發酵罐放大驗證：發酵周期為140h時，發酵產酸水平為185g/L，達到既定篩選優勢菌株效果。

三、討論

選取生產保藏菌株QJ-EY09作為誘變育種出發菌株，合理制定紫外-超聲波誘變方法，復篩出正突變菌株；利用兩步濃縮法及顯色平板篩分，獲得α，ω-氧化增強、β-氧化減弱的誘變突變株56株；經發酵罐驗證，發酵140h產酸185克/升，達到了篩選產酸水平高、烷烴轉化率高的優勢菌株的目的。

參考文獻

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作者簡介：姚嘉旻（1981—），男，江蘇淮安人，研究方向：石油產品相關的發酵工程及分離工程。