煙熏大鼠心肌組織中缺氧誘導因子-1α和血管內皮生長因子的表達

劉洋 閆蕊 李祥廷

煙熏大鼠心肌組織中缺氧誘導因子-1α和血管內皮生長因子的表達

劉洋1閆蕊2李祥廷1

目的 研究缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和血管內皮生長因子（VEGF）在煙熏大鼠心肌組織中的表達，探討吸煙對大鼠心肌損傷的影響及可能機制。方法 SD大鼠隨機分入對照組和實驗組，實驗組給予煙熏干預，8周后觀察心肌形態學改變，并通過免疫組化染色及蛋白質印跡法觀察HIF-1α、VEGF在兩組大鼠心肌組織中的表達情況。結果 與對照組比較，實驗組大鼠心肌細胞排列紊亂，且較為稀疏，部分肌原纖維扭曲甚至斷裂。免疫組化染色及蛋白質印跡法結果顯示，與對照組比較，實驗組HIF-1α表達顯著增加，而實驗組VEGF表達顯著下調（P＜0．05）。結論 吸煙可通過誘導大鼠心肌組織中HIF-1α表達上調、抑制VEGF表達進而介導心肌損傷。

煙熏；心肌組織；缺氧誘導因子-1α；血管內皮生長因子

吸煙會對心血管系統產生不利影響，是冠心病發生和進展的一個重要獨立危險因素[1]。作為主要的可預防性環境有害因素，吸煙對心血管系統的影響及其發病機制也越來越受到人們的關注。

缺氧誘導子因子-1（HIF-1）是一種隨著細胞內氧濃度變化而調節基因表達的轉錄激活因子，為異二聚體，由氧調節亞單位HIF-1α和結構亞單位HIF-1β組成。在正常氧濃度下，HIF-1α的氧依賴降解結構域上的特異性脯氨酰基被氧依賴性脯氨酰羥化酶羥基化，繼而與腫瘤抑制蛋白結合，通過泛素-蛋白酶途徑使HIF-1α迅速降解[2]。而在低氧條件下，HIF-1α穩定性增加，與HIF-1β亞單位結合形成二聚體HIF-1，進而激活轉錄過程[3]。HIF-1α既是HIF-1的調節亞基又是活性亞基，HIF-1的生理活性主要取決于HIF-1α的活性和表達。血管內皮生長因子（VEGF）是特異性的血管生成正性調節因子，具有促進內皮細胞分裂與增值、誘導新生血管生成、增加微血管通透性等重要生物學功能[4]。VEGF基因是受HIF-1α調控的重要靶基因之一，多項研究表明缺血性心臟病患者體內HIF-1α、VEGF的表達增加，然而目前尚未見到有關吸煙對心肌組織HIF-1α、VEGF表達的影響的報道。本研究通過煙熏干預建立動物模型，旨在通過研究煙熏大鼠心肌組織形態學改變及其HIF-1α、VEGF的表達情況，探討吸煙對心肌損傷的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠18只，體質量（150±15）g，均購于西安交通大學實驗動物中心。所有動物在室溫下飼養，均自由進食、進水，接受自然光照。七匹狼烤煙型香煙，福建中煙工業有限責任公司；山羊抗鼠血清，博士德生物工程有限公司；一抗為抗HIF-1α抗體、抗VEGF抗體，Abcam公司；二抗試劑盒，中杉金橋生物技術有限公司；DAB顯色劑，博士德生物工程有限公司；BCA試劑盒，碧云天生物技術有限公司；內參β-actin單克隆抗體，三鷹生物技術有限公司；HRP-標記的羊抗兔IgG多克隆抗體，西安壯志生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組處理 將18只SD大鼠隨機分為對照組和實驗組，將實驗組（n=9）大鼠置于30 cm×40 cm×60 cm的透明密閉容器內予以香煙煙熏，5支/次，30 min/次，2次/日，兩次之間間隔6小時，共8周；對照組（n=9）大鼠自由進食，共8周。

1.2.2 心肌形態學觀察 處死大鼠后取其心肌組織，進行以下操作：石蠟包埋，切片機切片，烤片，脫蠟至水，放蘇木素液內5分鐘，水洗，2%鹽酸酒精分化10秒，水洗，放入1/500的氨水中至切片變藍，水洗，放1%伊紅內染5分鐘，水洗，脫水透明，樹膠封片，鏡下觀察并圖像保存。

1.2.3 免疫組化 檢測大鼠心肌組織中HIF-1α、VEGF的表達，具體操作步驟如下（以HIF-1α為例）：石蠟切片脫蠟至水，應用pH值為6.0、濃度為0.01 M的檸檬酸緩沖液微波進行抗原修復，3% H2O2去離子水孵育10 min，消除內源性過氧化物酶活性，PBS洗滌，加入山羊抗鼠血清封閉，室溫孵育15 min，加入1：250稀釋的一抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌后滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS洗滌后加入辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗。DAB顯色工作液避光孵育10 min，PBS沖洗后蘇木素復染1 min，自來水沖洗。脫水、透明，封片后顯微鏡下觀察。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western Blot） 使用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，計算50 μg蛋白量進行SDS-PAGE電泳，繼而轉印到PVDF膜，脫脂奶粉封閉后分別用HIF-1α 抗體（1∶ 2 000）、VEGF抗體（1∶3 000）及β-actin抗體（1∶900）4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌后以相應Ⅱ抗室溫孵育2 h，ECL法顯影并用CCD相機拍照，采用UVP Software軟件分析。以β-actin 作為內部參照。

1.2.5 統計學分析 采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行分析，各實驗數據均以（x-±s）表示，組間差異采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠心肌組織形態學比較

由圖1-A和圖1-B對比可見，對照組心肌細胞排列有序、致密，而實驗組心肌細胞排列紊亂，且較為稀疏，部分肌原纖維扭曲甚至斷裂。

2.2 兩組大鼠心肌組織中HIF-1α、VEGF表達水平的比較

圖2、圖3分別表示通過免疫組化染色觀察HIF-1α、VEGF在兩組大鼠心肌組織中的表達情況，圖中棕黃色顆粒為所標記目的蛋白。如圖所示，實驗組HIF-1α表達水平高于其在對照組中的表達水平；而實驗組VEGF的表達水平卻低于其在對照組中的表達水平。

圖4表示通過Western Blot測定的HIF-1α、VEGF在大鼠心肌組織中的表達情況。其結果與通過免疫組化法測定相一致，即：與對照組相比，實驗組HIF-1α表達水平升高[（1.00±0.20）vs.（5.67±0.86）]（t=-8.882，P＜0.05），而VEGF的表達水平降低 [（1.00±0.09）vs. （0.31±0.12）]（t=8.727，P＜ 0.05）。

圖1-A 對照組心肌組織HE染色結果

圖1-B 實驗組心肌組織HE染色結果

圖2-A 對照組心肌組織HIF-1α免疫組化染色結果

圖2-B 實驗組心肌組織HIF-1α免疫組化染色結果

圖3-A 對照組心肌組織VEGF免疫組化染色結果

圖3-B 實驗組心肌組織VEGF免疫組化染色結果

3 討論

本研究得出以下結論：吸煙促使大鼠心肌損傷，表現為心肌細胞排列紊亂、肌原纖維扭曲斷裂；同時，吸煙可以上調大鼠心肌組織中HIF-1α表達并下調VEGF表達，提示吸煙有可能通過此途徑損傷心肌。

吸煙對心血管系統危害甚大，有文獻報道，長期大量吸煙者副交感神經張力明顯降低[5]，減弱其對交感神經興奮的拮抗作用，同時香煙中的尼古丁成分亦可興奮交感神經。因此，吸煙可以引起交感神經興奮性增高，導致吸煙者心率增快、心肌收縮力增強、動脈收縮，從而使得心肌耗氧量增加、心肌供氧量不足，心肌處于缺氧狀態。此外，吸煙后人體血液中COHb增加，COHb增多使Hb運輸氧的能力減低，進一步加重了心肌缺氧[6]。缺氧環境使HIF-1α激活[7]，進而表現為HIF-1α表達增加。HIF-1的表達與活性除了主要受細胞氧濃度調節外，還受到其他一些重要的信號轉導途徑的調節，如PI3K及ERK/MAPL途徑等[8]。吸煙是否影響了除細胞氧濃度外的其它途徑，仍需進一步研究。

HIF-1表達增加是缺氧早期首發的分子水平的適應性反應，通過作用于靶基因，參與血管再生、紅細胞生成、凋亡、細胞分化、糖代謝、pH值調節等。VEGF基因是受HIF-1α調控的重要靶基因之一，在VEGF 5’端增強子內存在HIF-1α結合位點，缺氧能夠激活HIF-1αDNA結合活性，HIF-1α與VEGF 5’端增強子結合后使VEGF的轉錄和表達增強[9]。VEGF是內皮細胞特異性的促有絲分裂原，是最重要的促血管形成的誘導因子之一[10]。已有臨床研究提示，心肌缺血缺氧越重，血清HIF-1α與VEGF的表達水平越高，且考慮VEGF表達增加受HIF-1α表達增加的激活與調控[11]。而在本研究中，煙熏大鼠心肌中VEGF的表達水平并未隨HIF-1α的表達增加而增加，反而明顯降低。國內外研究表明，吸煙抑制冠脈側支循環的形成。由于VEGF的作用是促進新生血管形成，因此，我們認為吸煙可能通過抑制VEGF的表達而影響了冠脈側支循環的形成。在這種情況下，缺血缺氧心肌無法有效形成新生血管，不能對缺血缺氧產生代償性適應，進一步加重心肌損傷。

綜上，吸煙引起心肌損傷，為適應吸煙導致的心肌缺氧，心肌中HIF-1α的表達上調，但吸煙通過抑制VEGF的表達影響了冠脈側支循環的形成，加重對心血管系統的危害。已有臨床試驗表明[12]，經冠狀動脈注射重組人血管內皮生長因子可使心肌血流量呈劑量依賴性改善。心肌供血量的增加能夠緩解心肌缺血缺氧狀態，進而改善冠心病患者預后。因此，有關VEGF的進一步研究將為具有長期大量吸煙史的冠心病患者的治療提供了新的途徑。

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The Expression of Hypoxia-Inducible Factor-1α and Vascular Endothelial Growth Factor in Cardiac Muscle Tissue of Smoked Rats

LIU Yang1 YAN Rui2 LI Xiangting1 1 Department of Internal Medicine,Affiliated Hospital of Ji’ning Medical College, Ji’ning Shandong 272100,China; 2 Department of Cardiology, The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiao Tong University, Xi'an Shanxi 710004, China

ObjectiveTo explore the expression of hypoxia-inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor in cardiac muscle tissue of smoked rats, and to discuss the effect of smoking on muscle tissue of rats and possible mechanism.MethodsSD rats were randomly divided into control group and experimental group, and experimental group was intervened by smoking. After 8 weeks, cardiac muscle tissue of rats was observed in morphology, and the expression of HIF-1α and VEGF were explored through immunohistochemical technique and Western Blot.ResultsCompared with control group, cardiac muscle tissue of smoked rats was arranged in disorder and sparsely, and some muscle fibril was twisty and even fractured. The expression of HIF-1α in experimental group was higher than it in control group, but the expression of VEGF in experimental group was lower than it in control group.ConclusionSmoking may damage cardiac muscle tissue of rats through increasing the expression of HIF-1α and lowering the expression of VEGF.

smoked; cardiac muscle tissue; hypoxia-inducible factor-1α;vascular endothelial growth factor

R3

A

1674-9316（2017）21-0132-05

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．21．069

國家自然科學基金面上項目（81570382）

1濟寧醫學院附屬醫院心內一科，山東 濟寧 272100；2 西安交通大學第二附屬醫院心內科，陜西 西安 710004

李祥廷