53份臍帶血干細胞制備的初探

鐘昌瑞，李玉閩，邱小蘭，闕慶和

(福建醫科大學附屬龍巖市第一醫院輸血科，福建 龍巖364000)

53份臍帶血干細胞制備的初探

鐘昌瑞，李玉閩，邱小蘭，闕慶和

(福建醫科大學附屬龍巖市第一醫院輸血科，福建 龍巖364000)

目的 制備符合臨床治療需求的干細胞制劑，觀察臍帶血量與提取的細胞數之間的關系。方法 本院產科足月妊娠剖腹產分娩的53例嬰兒胎兒娩出并斷臍后，在清潔狀態下迅速采集臍帶血于采血袋中，用負收集法分離提取臍帶血干細胞。用Sysmex-2100全血細胞分析儀計數提取干細胞懸液的單個核細胞總數。結果 采集的凈臍帶血量為88.9±15.4(70～180)m l，提取干細胞后的單個核細胞計數為3.8±1.73×109[（2.0～6.7）×109]，運用散點圖相關分析，兩者相關系數r為0.82。結論 提取的單個核細胞含量隨臍帶血量增加而升高，二者之間呈正相關（r=0.82）。在日常操作中如果能獲得較多的臍帶血應該就能收集到更多的用于移植的細胞，應用這新的造血干細胞來源，用于任何一個需要移植的病人。

臍血；干細胞；分離；正相關

臍帶血（umbilical cord blood，UCB）是產后留存在胎盤和臍帶中的血液，以往被作為醫學廢物而丟棄[1]。近十幾年的研究發現，人臍帶中存在大量間充質干細胞，間充質干細胞(mesenchymal stern cells，MSCs)是成體干細胞的一種，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能，可以重建人體造血和免疫系統的造血干/祖細胞，可用于造血干細胞移植，治療多種疾病[2]。我們采用負收集混合法，制備了53份臍帶血干細胞制劑供臨床移植使用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器人類骨髓、臍帶血干細胞/祖細胞體外分離純化試劑盒 （寧夏中聯達生物技術有限公司）。采血袋（四川南格爾生物醫學股份有限公司），D5KR低溫離心機。全自動細菌培養儀和配套標準的血培養瓶，Sysmex-2100全血細胞分析儀。分離、純化所用的離心管、移液管一次性無菌產品及0.4%臺盼藍染液由寧夏中聯達生物有限公司提供。蘇凈安泰VS-1300L-U100級的潔凈工作臺、顯微鏡、電動移液器、微量移液器、中科美菱貯血/試劑冰箱。

1.2 供血產婦的選擇供血產婦為本院2011年1月至2016年5月期間產科足月妊娠剖腹產分娩的產婦，排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒以及其他傳染性疾病，無家族遺傳性疾病和各種急、慢性疾病，妊娠期內無嚴重合并癥。

1.3 臍帶血的采集在產婦及家屬知情并同意捐贈的情況下，用采血袋（CPDA抗凝）封閉式收集第3產程剖宮產的新生兒臍帶血，每袋采臍血 （60～180）ml/例，采集好的臍血迅速送至百級層流細胞分離實驗室備用。

1.4 臍血干細胞制備采用負收集混合法分離提取臍帶血干細胞。嚴格按照體外分離純化試劑盒的操作步驟進行分離提取，用生理鹽水重復洗滌3次后，即得干細胞。每例提取的臍帶血干細胞以生理鹽水稀釋到100ml制備成干細胞懸液制劑[3]，立即通過靜脈進行干細胞移植。

1.5 病原微生物的檢測術前常規進行母體血標本的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV）、梅毒螺旋體（TP）等病原微生物檢測；細菌學檢查：取干細胞制備的上清液10ml（末次離心），用全自動細菌培養儀和配套標準的血培養瓶進行真菌和細菌檢測，排除干細胞懸液受污染的可能。上清液在干細胞懸液的上方，因此，上清液如不受細菌污染，可以排除干細胞懸液污染的可能。

1.6 臍血干細胞含量檢測用Sysmex-2100全血細胞分析儀的HPC模式，計數提取干細胞后單個核細胞數[4]。

1.7 細胞存活率檢測使用0.4%臺盼藍染色法計數活細胞數目。干細胞懸液與0.4%臺盼藍染色液以9：1混合混勻后滴入血球計數盤內，在3min內按白細胞計數法，分別計數活細胞數和死細胞數。統計細胞存活率=活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%。

1.8 統計方法運用散點圖相關分析探討臍帶血量與提取干細胞后單個核細胞數的相互關系，|r|＞0.95 為顯著相關，|r|≥0.8 為高度相關，0.5≤|r|＜0.8為中度相關，0.3≤|r|0.5為低度相關，|r|＜0.3為不相關，r=0為無線性相關。

2 結果

2.1 干細胞制劑安全性檢測53份臍血母體標本的病源微生物指標檢測全部合格。干細胞制劑制備的上清液經5d的細菌、真菌培養，均未發現細菌、真菌的污染。移植的患者均未發現嚴重不良反應及并發癥，移植后大多數患者的臨床癥狀明顯改善。

2.2 細胞數檢測臍血在手術當天以剖宮產方式取得，采集的凈臍帶血量為88.9±15.4(70～180)ml，提取干細胞后的單個核細胞計數為3.8±1.73×109[（2.0～6.7）×109]， 提取的單個核細胞含量隨臍帶血量增加而升高，二者之間呈正相關（r=0.82），具體如圖1所示。

圖1 臍帶血量與單個核細胞數的相關性，且成正相關，r=0.82。

2.3 干細胞活力檢測細胞經臺酚藍染色后，在顯微鏡下可見活細胞（不著色并保持正常形態，有光澤），而死細胞（著淺藍色并膨大，無光澤）。在鏡下分別計數活細胞數和死細胞數，根據公式計算分離的干細胞活率為（98.2±0.63%）。

2.4 干細胞臨床應用53例干細胞主要用于血液性疾病，風濕性疾病，股骨頭壞死等，詳見圖2。

3 討論

圖2 53例干細胞臨床應用分布

干細胞是人體及其各種組織細胞的最初來源，具有高度自我復制、增殖和多向分化的潛能。干細胞按其來源分類可以分為外周血干細胞、骨髓干細胞和臍帶血干細胞[5]。與骨髓和外周血相比，臍帶血具有以下優點：⑴臍帶血來源廣泛，目前有許多國內外的研究表明可以從臍帶的不同部位(臍帶靜脈內皮，內皮下層，Wharton's jelly，血管及其周圍組織)分離得到MSCs[6]。⑵臍帶血中的干/祖細胞較成人骨髓中的干/祖細胞更原始，有更強的增殖分化能力。⑶臍帶血中淋巴細胞的免疫功能不夠成熟，未接受外界抗原刺激，其免疫原性較弱，移植物抗宿病發生率低[7]。⑷臍帶血中不會有腫瘤細胞[8]。⑸臍帶血中間充質干細胞易于分離[9]。有資料顯示，臍帶血干細胞制劑中主要以MSCs為主，其含量濃度很高[3]。臍帶血間充質干細胞有多向分化潛能，它在體內可以分化為骨、軟骨細胞、骨骼肌細胞、肝細胞、心肌細胞以及神經元細胞等[10]，因而臍帶血干細胞具有極大的臨床應用價值。

臍帶血干細胞治療在我院作為新技術新項目引入，主要通過多個科室間的合作完成，我科負責臍帶血干細胞的分離、純化工作。臍帶血干細胞分離要求在萬級潔凈實驗室里進行，臍帶血和試劑移取要求在局部百級潔凈臺內操作。臍帶血分離技術是臍血干細胞移植的關鍵環節，關于臍血干細胞提取分離方法還沒有統一的標準。因密度梯度離心法分離臍血單個核細胞有細胞得率高、方法簡單等優點[11]，現作為常用的分離方法。本文采用負收集混合法分離提取臍帶血干細胞，提取干細胞后的單個核細胞計數為 3.8±1.73×109[（2.0～6.7）×109]，提取的單個核細胞含量隨臍帶血量增加而升高，二者之間呈正相關（r=0.82）；分離的干細胞活率為 （98.2±0.63%）；53份干細胞制劑制備的上清液經5d的細菌、真菌培養，均未發現細菌、真菌的污染，移植患者均未發現嚴重不良反應及并發癥，移植后大多數患者的臨床癥狀明顯改善。因臍帶血干細胞分離需經數次離心并且多次移液，離心力、離心時間、離心次數及離心溫度等是影響制備效果的因素。離心力過大，離心時間過長或離心次數過多會增加干細胞死亡（細胞膜破裂）。此外，制備干細胞懸液勿劇烈震蕩，以免造成細胞破壞。臍血干細胞移植成功與否受到諸多因素的影響，如病種、年齡、宿主微環境、藥物干預等，供者因素中重要的是輸入細胞量[5]。為了保證臍帶血干細胞在臨床中更廣泛的應用，更好的療效，在日常操作中如果能獲得較多的臍帶血應該就能收集到更多的用于移植的細胞。因此，對操作人員要有規范系統的教育培訓，以具備操作的專業知識和能力，才能收集到更多質量更好的干細胞。

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R457.1+2，R446.11+1

A

1674-1129(2017)05-0810-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.063

李玉閩。

2017-03-09；

2017-06-05)