云南野生茶樹資源兒茶素多樣性分析

段志芬，馬 玲，李友勇，矣 兵，楊盛美，汪云剛，孫雪梅，劉本英

(云南省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，云南省茶學重點實驗室，云南 勐海 666201)

云南野生茶樹資源兒茶素多樣性分析

段志芬，馬 玲*，李友勇，矣 兵，楊盛美，汪云剛，孫雪梅，劉本英**

(云南省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，云南省茶學重點實驗室，云南 勐海 666201)

【目的】了解云南野生茶樹兒茶素遺傳多樣性，為選育特異茶樹資源提供理論依據(jù)。【方法】采用高效液相色譜法對100份云南野生茶樹資源的兒茶素組分進行了檢測,分析了8種主要兒茶素組分的含量。【結(jié)果】參試的茶樹資源兒茶素組分存在豐富的多樣性和變異，變異系數(shù)0.2912 %～0.5669 %；以野生茶樹資源兒茶素組分為基礎(chǔ),可將100份野生茶樹資源聚類為 A、B 2個組群。【結(jié)論】A類群表現(xiàn)為酯型兒茶素含量低,可適制紅茶；B類群表現(xiàn)為酯型兒茶素含量高，發(fā)現(xiàn)安定野茶、黃泥河大茶、西舍路大茶、巴達二號、勐養(yǎng)從茶5個酯型兒茶素含量高的資源，可作為適制綠茶的優(yōu)質(zhì)品種；閘上大樹茶、十八連山大茶、底圩白毛茶、龍樹茶4非酯型兒茶素較低，非酯型兒茶素最高的大黑山野生茶，可作為選育專用品種的特異種質(zhì)資源材料。

云南；野生茶樹；兒茶素；多樣性

【研究意義】野生茶樹是山茶科(Theaceae)山茶屬(camellia)茶組(SectionThea)植物野生種類的總稱,其葉均可制做茶葉，屬于亞熱帶常綠植物。野生茶樹是遺傳多樣性最豐富，最具有保存和研究價值的初級茶樹種質(zhì)資源[1-3]，野生茶樹資源中蘊含的許多特異性狀，如高茶多酚、低咖啡堿、高茶氨酸、高茶黃素、高抗性基因資源等可以直接利用[4-7]，也可以作為遠緣雜交基因，嫁接基因等高科技育種材料以進行突破性育種。云南是茶樹起源的中心地帶，也是國內(nèi)野生茶樹保存數(shù)量最多、分布最廣的地區(qū)。【前人研究進展】茶樹中的兒茶素屬于類黃酮物質(zhì)(flavonids)中的黃烷-3-醇(flavonols)類物質(zhì)[8-10]，分為酯型兒茶素(ECG、EC、EGCG、EGC)和非酯型兒茶素(C、GA、GCG、GC)，是茶葉的主要化學成分之一。兒茶素總量，不同單體含量可作為判斷茶樹品種適制性及茶葉用途的重要指標[11-13]。利用多樣性對品種資源進行分類，能較真實地表現(xiàn)品種的綜合性狀，結(jié)果較穩(wěn)定的，可為育種取材提供客觀依據(jù)。

【本研究切入點】文章通過研究保存在“國家種質(zhì)大葉茶樹圃(勐海)”中的100個云南野生茶樹種質(zhì)資源的兒茶素含量及遺傳多樣性的關(guān)系，揭示不同野生茶樹種質(zhì)資源各種兒茶素的形態(tài)變化規(guī)律。【擬解決的關(guān)鍵問題】為客觀評價云南野生茶樹遺傳多樣性提供理論依據(jù)，為云南茶樹良種選育和生產(chǎn)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料取自國家種質(zhì)大葉茶樹資源圃(勐海)100份野生茶樹資源(表1)。

表1 100份野生茶樹資源及原產(chǎn)地Table 1 100 wild tea resources and origin

續(xù)表1 Continued table 1

1.2 方法

1.2.1 固樣及茶樣處理方法 采摘鮮葉→攤青→殺青→揉捻→80 ℃恒溫箱干燥→將部分茶樣用高速粉碎機粉碎、過篩，粒度 40～60 目，備用。

1.2.2 兒茶素測定 兒茶素測定采用高效液相色譜法[14]。

試液制備：準確稱取茶粉1.0000 g，加入80 %(V/V，下同)甲醇100 mL，于30 ℃水浴中超聲提取20 min，經(jīng)濾紙過濾，洗滌濾渣3次后合并濾液，定容至200 mL，用0.45 μm濾膜過濾后備用[15]。

混合標樣的配制： 標準儲備液：分別稱取6種兒茶素類化合物的固體標樣各10 mg，用50 %的甲醇水溶液溶解并定容至10 mL，則6種兒茶素類化合物的標準儲備液濃度均為1 mg/mL。

色譜檢測條件： 采用GB/T 8313-2008中的方法進行檢測。流動相：A為甲醇，B為乙腈；流動相的梯度為從10 %的乙腈到 60 %的乙腈，流速1 mL/min，在36 min內(nèi)完成；色譜柱為waters-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；檢測波長280 nm。每次檢測完成后，系統(tǒng)平衡15 min后重復3次進樣。所得數(shù)據(jù)用Empower軟件處理。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Excel計算各兒茶素的平均值、最大值、最小值、標準差、變異系數(shù)。利用SPD統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析，采用離差平方和法，距離為歐氏距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生茶樹資源兒茶素含量分析

從圖1可以看出，100份野生茶樹兒茶素組分含量變化幅度都很大，其中兒茶素總量的變化區(qū)間最大，從1.86～18.20，其次是EC、EGCG、C、EGC、ECG、GC、GCG、變化最小的是GA，從0.03～0.14。

圖1 兒茶素含量變化趨勢Fig.1 The change trend of catechin content

2.2 兒茶素含量變異分析

對100份云南野生茶樹C、ECG、EC、EGCG、EGC、GA、GCG、GC、兒茶素總量進行基本統(tǒng)計分析(表2)。結(jié)果表明，云南野生茶樹資源的兒茶素組分有明顯的差異性。由表2可知，大黑山野茶的C、ECG、EC、EGCG、GCG含量最低，分別是0.22、0.07、0.15、0.09、0.12；C含量最高的是巴達二號，為4.65； ECG含量最高的是勐養(yǎng)叢茶，為3.91；EC最高的是安定野茶，為6.04；EGCG、EGC、GCG含量最高的分別為黃泥河大茶5.32、西舍路大樹茶4.07、阿偉茶0.44。GA含量最低的是閘上大樹茶，底圩白毛茶，十八連山茶，都為0.03；GA含量最高的是大黑山野茶，為0.14；GC含量最低的是龍樹茶，為0.12，最高的是大黑山野茶，為0.91；兒茶素總量最低的是大黑山野茶，為1.86，最高的是達諾茶，達到18.20。

兒茶素各組分中變異系數(shù)最大的是ECG，為0.5669 %，其次是EGCG，為0.5172 %，GCG和兒茶數(shù)總量的變異系數(shù)較低，小于0.3 %，分別為0.2922 %和0.2942 %。各兒茶素單體和兒茶素總量的平均變異系數(shù)達到0.4237 %。

表2 兒茶素含量變異分析Table 2 Analysis of catechins content variation

圖2 兒茶素組分聚類圖Fig.2 Catechins composition clustering

2.3 兒茶素聚類分析

根據(jù) 9個兒茶素組分的分析數(shù)據(jù)，對 100份云南野生茶樹資源進行聚類(圖 2)，結(jié)果100個云南野生茶樹資源在遺傳距離為51.4處可分成 A、B 2個組群。A 組有 62 個資源，分成2個亞群：一個亞群包含涌寶白毛茶，邦東大茶樹等40個資源，另一個亞群包括大黑山野茶、阿偉茶、弄島野茶等22個資源。B類群有38個野生茶樹資源，主要表現(xiàn)為酯型兒茶素含量較高。也分成2個亞群，一個亞群包括景新小黃茶、威車茶，牛洪茶、曼噴龍大葉茶等32個資源，主要特征為兒茶素含量很高，其中包括酯型兒茶素含量最高的安定野茶、黃泥河大茶、西舍路大茶、巴達二號；另一個亞群包含邦外黑茶、新華緬甸大山茶、勐養(yǎng)叢茶、漭水小茶、小坡頭茶、達諾茶等6個資源。其中勐養(yǎng)叢茶的酯型兒茶素ECG含量最高。

2.4 優(yōu)異種質(zhì)資源

隨著茶葉功能保健功效的不斷深入研究，茶氨酸、茶多酚、咖啡堿、兒茶素等含量特異的種質(zhì)資源呈現(xiàn)出廣闊的應用前景。阮宇成等[16]研究表明綠茶品質(zhì)隨著酯型兒茶素含量的增加而提高。根據(jù)兒茶素組分鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參試的茶樹種質(zhì)資源酯型兒茶素含量高的安定野茶、黃泥河大茶、西舍路大茶、巴達二號、勐養(yǎng)叢茶; 非酯型兒茶素較低的閘上大樹茶、十八連山大茶、底圩白毛茶、龍樹茶；還有酯型兒茶素最低，非酯型兒茶最高的大黑山野生茶都屬于優(yōu)異的種質(zhì)資源。

3 討 論

茶樹種質(zhì)資源是新品種選育的基礎(chǔ)，包括表型性狀、染色體、蛋白質(zhì)、DNA 和堿基序列等多層次遺傳變異[17-18]。茶葉中兒茶素類化合物是茶葉中含量豐富的一類功能性成分，在新茶葉中的質(zhì)量分數(shù)(以干茶為計)為13 %～32 %[18]，由于兒茶素具有廣泛的保健功效以及較強的食品抗氧化特性，茶葉中兒茶素近年來已成為醫(yī)藥和食品研究領(lǐng)域的熱點之一。本研究從兒茶素組成成分的角度，對100份云南野生茶樹進行了多樣性的研究。發(fā)現(xiàn)100份野生茶樹資源兒茶素變異系數(shù)從0.2912 %到 0.5669 %，變異類型比較豐富。既有進化較高的類型，也有保存了原始的類型。聚類分析在遺傳距離為51.4處把100份野生茶樹資源分成 A、B 2個組群。A 組包括 62 個資源，主要適制紅茶。B類群包含有38個野生茶樹資源，主要表現(xiàn)為酯型兒茶素含量較高。發(fā)現(xiàn)安定野茶、黃泥河大茶、西舍路大茶等酯型兒茶素含量高的資源和兒茶素含量最高的達諾茶，可用于制作綠茶；這些特異茶樹種質(zhì)可以直接利用或作為中間的育種材料，為選育專用品種和特異種質(zhì)資源提供了科學依據(jù)，對今后的品種改良和作為特殊用途的茶及功能成分的提取具有重要的意義。

4 結(jié) 論

A類群表現(xiàn)為酯型兒茶素含量低,可適制紅茶；B類群表現(xiàn)為酯型兒茶素含量高，發(fā)現(xiàn)安定野茶、黃泥河大茶、西舍路大茶、巴達二號、勐養(yǎng)從茶5個酯型兒茶素含量高的資源，可作為適制綠茶的優(yōu)質(zhì)品種；閘上大樹茶、十八連山大茶、底圩白毛茶、龍樹茶4非酯型兒茶素較低，非酯型兒茶素最高的大黑山野生茶，可作為選育專用品種的特異種質(zhì)資源材料。

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DiversityAnalysisonCatechinGeneticofWildTeaPlantfromYunnanProvince

DUAN Zhi-fen,MA Ling*,LI You-yong,YI Bing,YANG Sheng-mei,WANG Yun-gang,SUN Xue-mei,LIU Ben-ying**

(Tea Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science,Yunnan Menghai 666201,China )

【Objective】The present paper aims to study the genetic diversity of wild tea catechins in Yunnan province and provide a theoretical basis for breeding special tea tree resources.【Method】The components of catechin for 100 Yunnan wild tea tree resources were detected and the component contents of eight major catechins were analyzed by using high performance liquid chromatography (HPLC)method.【Result】 The components of tea catechins tested had rich diversity and variation,Its variation coefficient ranged from 0.2912 % to 0.5669 %.100 wild tea tree resources by clustering were divided into group A and group B according to catechin components of wild tea tree resources.【Conclusion】 Group A with the low content of ester type catechins was used to product black tea.Group B showed a high content of ester type catechins.Five quality varieties (Andingyecha,Huangnihedacha,Xisheludacha,Badaerhao and Mengyangcongcha)with the high content of ester type catechins were found and used to product green tea.Four varieties (Zhashangdachashu,Shibalianshandacha,Diweibaimaocha and Longshucha)showed the lower of nonester type catechins as well as the lowest of ester type catechins.Daheishan wild tea had the highest of nonester type catechins.They could be used as breeding special varieties and specific germplasm materials.

Yunnan; Wild tea tree; Catechin; Genetic diversity

1001-4829(2017)4-0722-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.002

2015-06-05

國家自然科學基金項目 (31440034；31160175)；農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源保護與利用專項(2014NWB028)；農(nóng)業(yè)部948項目(2014-Z56)

段志芬(1976-)，白族，女，云南大理人，副研究員，主要從事茶樹資源研究,E-mail：zzffd@sina.com,*為并列第一作者，**為通訊作者,劉本英，E-mail：liusuntao@126.com。

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(責任編輯 王家銀)