轉染HBx誘導肝癌細胞株Bel—7404多藥耐藥的初步研究

林松挺　陳正義　鐘文洲

[摘要] 目的 研究HBx轉染對肝癌細胞株Bel-7404增殖、細胞周期以及多藥耐藥的影響，并探討HBx轉染誘導肝癌多藥耐藥發生的可能機制。 方法 選用人肝癌Bel-7404細胞株進行轉染，根據HBx轉染情況將細胞分為三組，分別為轉染HBx細胞組（Bel-7404-HBx組）、轉染空載體細胞組（Bel-7404-con組）和空白細胞組（Bel-7404組）；實時定量PCR檢測各組細胞中HBx RNA的表達。Western blot法檢測各組細胞中HBx、Notch-1和多藥耐藥蛋白（MRP）的表達，CCK-8法檢測各組細胞增殖活性和多藥耐性，流式分析儀檢測各組細胞生長周期。 結果 PCR擴增凝膠電泳顯示Bel-7404-HBx組有HBx片段出現，而其他兩組未見HBx mRNA的表達；Western bolt結果顯示在Bel-7404-HBx組處有蛋白條帶（即HBx蛋白），而Bel-7404組和Bel-7404-con組未見表達。與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，Bel-7404-HBx組細胞增殖顯著加快（P < 0.05）；與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，Notch-1和MRP在Bel-7404-HBx組的蛋白表達增加；細胞周期結果顯示，與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，Bel-7404-HBx組G0/G1期細胞顯著減少（P < 0.05），S期顯著增加（P < 0.01），G2/M期變化不大（P > 0.05）；多藥耐藥實驗顯示，與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，絲裂霉素、阿霉素、5-氟尿嘧啶、順鉑和奧沙利鉑在Bel-7404-HBx組中耐藥指數明顯增加（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 轉染HBx的Bel-7404細胞可能通過誘導Notch-1與MRP的過表達，最終導致肝癌細胞株Bel-7404增殖能力增強和多藥耐藥的發生。

[關鍵詞] HBx；肝癌細胞株；Bel-7404；Notch信號通路；多藥耐藥蛋白；多藥耐藥

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（c）-0016-05

[Abstract] Objective To study the effects of HBx transfection on proliferation， cell cycle， and multidrug resistance of hepatocellular carcinoma cell line Bel-7404， and to investigate the possible mechanism of HBx transfection in inducing the multidrug resistance of liver cancer. Methods Human hepatocellular carcinoma cell line Bel-7404 was transfected， and the cells were divided into three groups according to the transfection conditions， which were transfected HBx cell group （Bel-7404-HBx group）， transfected cell group with empty vector （Bel-7404-con group） and blank cells group （Bel-7404 group）. The expression of HBx RNA in all groups was detected by real-time PCR. The expression of HBx， Notch-1 and multi-drug resistance protein （MRP） in all groups was detected by Western blot， the cell proliferation activity and multidrug resistance in all groups were determined by CCK-8， and the cell growth cycle was analyzed by flow cytometer. Results PCR amplified gel electrophoresis showed that HBx fragments were detected in Bel-7404-HBx group， while no HBx mRNA expression could be found in the other two groups； Western blot indicated that the protein band （HBx protein） was detected in the Bel-7404-HBx group， while no expression was found in Bel-7404 group and Bel-7404-con group. Furthermore， compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the cell proliferation in Bel-7404-HBx group was increased significantly （P < 0.05）； compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the protein expression of Notch-1 and MRP in Bel-7404-HBx group was increased significantly； the results of cell cycle showed that， compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the number of cells in G0/G1 phase was decreased significantly （P < 0.05）， which was significantly increased in S phase （P < 0.01）， while there was no significant differences in G2/M phase （P > 0.05）； multidrug resistance experiments showed that， compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the resistance index of Mitomycin， Adriamycin， 5-Fluorouracil， Cisplatin and Oxaliplatin in the Bel-7404-HBx group was increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Bel-7404 cells transfected by HBx may induce overexpression of Notch-1 and MRP， leading to the increase of multiplication capacity of hepatocellular carcinoma cell line Bel-7404 and the occurrence of multidrug resistance.endprint

[Key words] HBx； Hepatocellular carcinoma cell line； Bel-7404； Notch signaling pathway； Multi-drug resistance protein； Multidrug resistance

傳統意義上的化療對肝癌的治療雖然取得了一定的療效，但是具有較大的毒副作用，其潛在引起了腫瘤細胞的耐藥性，并引發腫瘤細胞的擴散與轉移[1]。多藥耐藥是影響化療療效以及導致患者死亡的主要原因[2]。肝癌對化療藥物相對不敏感，對其如何發生多藥耐藥的機制仍不清楚，因此尋找多藥耐藥的原因尤為關鍵。HBx由HBV基因組編碼，具有多種調控功能，能激活多個與腫瘤侵襲相關的原癌基因及轉錄因子，是肝細胞癌發病的獨立危險因素[3-5]。Notch信號通路是一個重要的高度保守的細胞間信號轉導通路，其作用廣泛。最近的研究表明，Notch信號通路不僅對胚胎期腎臟的發育起至關重要的作用，而且參與多種腫瘤疾病的發生和發展[6]，Notch通路能夠通過血管內皮生長因子（VEGF）促進腫瘤血管的發生，從而參與促進腫瘤細胞的生長[7]，多藥耐藥蛋白（MRP）的過表達是肝癌產生多藥耐藥（MDR）的重要機制[8-9]。本研究采用基因轉染的方法將HBx基因轉入肝癌Bel-7404細胞中，觀察HBx對Bel-7404細胞中Notch信號通路和MRP表達的影響，并探討轉染對肝癌細胞增殖和多藥耐藥的影響及其可能的作用機制，為Bel-7404的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肝癌Bel-7404細胞株購自中科院上海生命科學院細胞庫，本所傳代保存，置于37℃、5%CO2、含10%胎牛血清RPMI-1640培養基（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）的恒溫培養箱內培養。

1.2 試劑

DMEM高糖細胞培養液（美國Gibco公司，批號：12100046）；DMEMF12（美國Gibco公司，批號：12400 024）；HBSS緩沖液（上海研卉生物技術有限公司，批號：BS0101）；FcR阻斷劑、寡核苷酸引物根據HBx基因的序列自行設計引物，由長沙贏潤生物公司合成；Trizol裂解液（美國賽默飛世爾科技，批號：15596026）；Taqman MicroRNA反轉錄試劑盒（美國賽默飛世爾科技，批號：4366596）；Lipofectamine 2000轉染試劑盒（美國賽默飛世爾科技，批號：722255）；Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（上海前塵生物科技有限公司，批號：40302ES20），B27補充劑（美國GIBCO，批號：17504-044）；CCK-8試劑盒（上海鈺博，批號：YB1198）；小牛血清（北京索萊寶公司，批號：01-045）；胰蛋白酶（北京瑞達恒輝科技發展有限公司，批號：HB-0103-01）；RPMI-1640培養基（美國GIBCO公司，批號：11875-093）。

1.3 方法

1.3.1 重組X質粒轉染肝癌Bel-7404細胞 Bel-7404細胞生長于含10%胎牛血清的DMEN中，以脂質體轉染的方法分別將重組x質粒、未重組x質粒轉染入Bel-7404細胞中，命名為轉染HBx細胞組（Bel-7404-HBx組）、轉染空載體細胞組（Bel-7404-con組）和空白細胞組（Bel-7404組），具體步驟如下：選取對數生長期Bel-7404細胞，胰酶消化接種于直徑25 cm培養瓶，細胞數為1×106/L，6 h后細胞即可貼壁，繼而進行轉染。37℃預熱的無血清培養基加入DNA 5 μg、Trans Fast Reagent 15 μL，立即渦旋混勻，室溫下靜置10～15 min。小心移出培養細胞的培養基，稍渦旋混勻脂質體/DNA混合物，輕輕加入培養瓶中，37℃孵育24 h，輕輕加入含血清的培養基（完全培養基）4 mL，不必移去脂質體/DNA混合物，37℃繼續孵育48 h。

1.3.2 實時定量PCR檢測HBx mRNA的表達 TRIzol試劑提取并收集處于對數生長期的三組肝癌Bel-7404細胞的HBx mRNA，RNA的完整性利用1%的瓊脂糖變性凝膠電泳進行檢測，RNA的純度和濃度利用紫外可見分光光度計檢測；在70℃（10 min）、冰育（2 min）、42℃（60 min）、70℃（10 min）反應條件下，利用逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA；在95℃（5 s）、60℃（20 s）、72℃（5 s）的反應條件下進行qRT-PCR反應，40個循環，進行3次重復試驗。

1.3.3 Western blot法檢測肝癌Bel-7404細胞中HBx、Notch-1和MRP的表達 轉染組和未轉染組進行細胞總蛋白的提取，通過Bradford的方法調整相同的蛋白濃度后，進行電泳獲得根據分子量分離的蛋白條帶，根據Pierce公司Western blot顯像試劑盒的指導說明來進行，蛋白的NC膜電轉，進行蛋白封閉和一抗結合，一抗結合后洗脫，再進行二抗孵育標記兔抗大鼠的多克隆抗體。ECL試劑盒顯色后，暗室發光拍照，以β-actin為內參進行系統軟件分析。

1.3.4 CCK8法檢測細胞增殖活性 取三組細胞以1×106/L接種于96孔板中，每孔100 μL，培養48 h后每孔加入10 μL CCK8試劑，4 h后在450 nm波長下檢測各孔OD值，重復3次取均值。以OD值為縱坐標、時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞周期 收集轉染48 h后的三組細胞，用冷PBS洗滌細胞后加入體積分數70%冷乙醇固定過夜。用流式細胞儀進行檢測，采用Cell Quet軟件分析細胞周期分布情況。實驗重復3次。

1.3.6 各組細胞耐藥性檢測 將三組處于對數生長的Bel-7404細胞制成濃度為1×106/L的細胞懸液，每孔100 μL，接種于96孔板，每孔設3個復孔。孵育24 h后，換用濃度為0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L絲裂霉素、阿霉素培養液，0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、250、500 μmol/L 5-氟尿嘧啶、順鉑、奧沙利鉑培養液。孵育48 h后，去除含藥液，每孔加100 μL不含藥培養基和10 μL CCK-8，設空白孔。孵育2 h后，酶標儀測吸光度值，設a為加藥組的吸光度，b為不加藥細胞組的吸光度，c為無細胞的空白組的吸光度，藥物對細胞的抑制率（%）=1-[（a-c）/（b-c）]×100%。計算5種藥物抑制率為50%的濃度（IC50）和耐藥指數（RI），RI=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。endprint

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBx mRNA的表達

將PCR擴增產物進行凝膠電泳，可見Bel-7404-HBx組有目的片段出現，而其他兩組未見HBx mRNA的表達。見圖1。

2.2 HBx蛋白的表達

Western bolt結果顯示，在Bel-7404-HBx組處有蛋白條帶（即HBx蛋白），而Bel-7404組和Bel-7404-con組未見表達。Notch-1和MRP在三組中的表達不同，在Bel-7404-HBx組的蛋白條帶最大，Bel-7404-con組次之，Bel-7404組最小。見圖2。

2.3 轉染HBx后各組細胞的生長曲線

與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，Bel-7404-HBx組細胞增殖顯著加快（P < 0.05或P < 0.01）。見圖3。

2.4 轉染HBx后細胞周期變化

與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，Bel-7404-HBx組G0/G1期細胞顯著減少（P < 0.05），S期顯著增加（P < 0.01），G2/M期變化不大（P > 0.05）。見表1。

2.5 耐藥性比較

與Bel-7404組和Bel-7404-con組比較，5種藥物在Bel-7404-HBx組中耐藥指數增加明顯（P < 0.05或P < 0.01），意味著Bel-7404-HBx組耐藥性增強，對且多種化療藥物產生耐藥。見表2。

3 討論

HBV慢性感染是世界范圍內原發性肝細胞癌的主要發病原因之一[10]，HBx基因致肝細胞癌發生的機制是目前研究的熱點。HBx基因存在于HBV基因的第4個閱讀框，具有強大的生物學功能，包括轉錄反式激活病毒基因組和宿主細胞基因、增強轉錄因子DNA結合特性、抑制p53蛋白活性、參與細胞信號傳導途徑和細胞凋亡的調節等。這些功能可能與肝細胞癌的發生具有密切的關系[11]。研究發現肝癌細胞組織中HBx呈彌漫性表達。一些體內及體外研究也發現HBx可誘導細胞的惡性轉化甚至參與癌變發生[12-13]。因此，觀察HBx對體外細胞增殖的影響，可為進一步研究HBx致肝細胞癌的發生機制提供依據和線索。

Notch信號在腫瘤的發生和演進過程中有重要作用，紊亂的Notch信號不僅能夠直接引起腫瘤的發生，而且可通過與其他多條信號通路的交互作用，以間接的方式最終誘導腫瘤的形成[14]，在很多組織腫瘤的發生過程中均出現了Notch信號通路的異常，Notch信號的激活可通過促進細胞增殖和抑肝癌細胞凋亡活化的Notch-1，通過增強CDK2和CycIinD的活性而促進細胞周期的進程[15]。本研究中利用qPCR檢測結果顯示，轉染的Bel-7404細胞內HBx的RNA和蛋白表達明顯，這意味著轉染Bel-7404細胞后構建過表達HBx的肝癌細胞成功。本研究還發現，轉染HBx的人肝癌Bel-7404細胞中的Notch-1蛋白表達明顯高于Bel-7404組和Bel-7404-con組，提示Bel-7404細胞中HBx的過表達誘導了細胞內Notch-1表達水平的增加，造成細胞內Notch信號通路的紊亂。同時細胞增殖和周期檢測結果顯示，轉染HBx后細胞增殖能力顯著提高，細胞生長周期S期增加，提示Notch-1的活化誘導了Bel-7404細胞增殖的發生。

腫瘤細胞的多藥耐藥是導致腫瘤細胞治療失敗和疾病復發的主要原因之一[16]。有報道指出，檢測患者體內MRP的表達可以作為監測惡性腫瘤細胞原發性耐藥的主要指標[17-18]。腫瘤細胞產生MRP與藥物外排泵ABC轉運蛋白的過度表達與細胞凋亡水平異常改變、DNA修復活性增強、細胞內酶異常改變和器官微環境改變有密切關系[19]，此外Notch-1信號與腫瘤細胞多藥耐藥的形成有重要的聯系，過表達的Notch-1能夠增加與多藥耐藥相關的ABBCC1基因的表達，誘導多藥耐藥現象的形成[20]。本研究發現，轉染HBx的Bel-7404細胞多藥耐藥明顯增強，這意味著轉染HBx的Bel-7404細胞可能通過誘導Notch-1和MRP的過表達，最終導致多藥耐藥的發生。此外，在此研究基礎上檢測Notch通路的活化情況及由此引起凋亡抑制蛋白livin的表達，同時研究livin的表達后多藥耐藥相關蛋白表達的變化，并觀察HBx、Notch通路活化、livin蛋白及多藥耐藥蛋白表達之間的相關性是下一步的研究重點，為乙肝相關性肝細胞癌開展新的臨床治療提供新靶點。

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（收稿日期：2017-06-13 本文編輯：張瑜杰）endprint