CRISPR/Cas9技術敲除水稻B R降解相關基因的研究

葉照楠，何 璐，張琳琳，李飛飛，劉文真

（1.浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江 臨安 311300；2.中國水稻研究所，水稻生物學國家重點實驗室，浙江 富陽 311400）

CRISPR/Cas9技術敲除水稻B R降解相關基因的研究

葉照楠1,2，何 璐1，張琳琳1，李飛飛1，劉文真2

（1.浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江 臨安 311300；2.中國水稻研究所，水稻生物學國家重點實驗室，浙江 富陽 311400）

油菜素內酯（BR）是一種常見的植物類激素，在植物的生長發育過程中起重要的調控作用，對水稻株型改良和抗逆性有重要作用。研究首先構建了水稻4個BR降解相關基因的CRISPR/Cas9載體；然后利用農桿菌介導法，將構建好的4個BR降解相關基因的 CRISPR/Cas9載體分別轉化水稻中花11的愈傷組織，用50 mg/L的潮霉素作為篩選標記，共獲得395株轉基因植株。其中，有270株屬于野生型，61株屬于雜合子類型，64株屬于突變類型；64株突變體中有39株是雜合突變體，25株是純合突變體，純合突變的概率為6.25%。4個基因均獲得了突變材料，但不同基因的突變效率不同，其中轉LW26的植株突變率高達41%。

油菜素內酯（BR）相關基因；CRISPR/Cas9系統；水稻遺傳轉化；靶位點鑒定

CRISPR/Cas9是最新出現的一種由RNA指導Cas9核酸酶對靶基因進行定向編輯的技術，是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。CRISPR/Cas9系統屬于CRISPR系統中的Ⅱ型系統，該系統主要包含crRNA（CRISPR RNA）、tracrRNA（transactivating crRNA）和核酸內切酶Cas9。利用CRISPR/Cas9系統進行基因編輯起關鍵作用的是Cas9蛋白。crRNA通過堿基配對與tracrRNA結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點切斷雙鏈DNA[1]。在基因組編輯過程中，tracrRNA和crRNA可以融合成為1條引導RNA（sgRNA）[2]，具有和crRNA與tracr RNA配合使用的相同功能，但因為sgRNA的結構得到了簡化，所以更方便研究者使用。CRISPR/Cas9操作簡單，對基因組的效率高。要編輯某一個靶位點的時候，不用改造Cas9核酸酶，只需表達相應的sgRNA就可對任何物種的基因組進行高效率的定向編輯。

油菜素內酯（BR）是植物界廣泛存在的一類植物激素[3]。研究表明，BR在植物的生長發育、細胞分裂和伸長、維管束分化、光形態發生、雄性生育能力、開花、衰老和種子萌發等過程中都起著重要作用[4]。Wu等[5]在試驗中發現水稻BR缺失突變體表現為葉窄而直立、植株矮小，且產量明顯增加。Qian等[6]也進一步在試驗中證實缺少油菜素內酯的brd3-D突變型水稻具有較矮的株型、較高的每穗粒數與結實率。Wu等研究表明在水稻根、莖、葉中特異性過量表達BR合成基因可以得到C22-羥化酶，從而提高水稻的分蘗數、灌漿率、每穗粒數、千粒重及產量。現代農業是以大田機械化及密集種植為前提的，油菜素內酯能控制水稻節間長度，從而降低植株高度，使植株更有利于進行光合作用及機械化作業[7]。因此，缺失BR有利于改善水稻品性，提高水稻產量。

研究擬利用CRIPSR/Cas9系統定向敲除水稻基因組上BR降解相關的同源基因，首先構建了4個水稻BR降解相關基因的CRISPR/Cas9敲除載體，通過農桿菌介導法轉化水稻中花11的愈傷組織，獲得轉CRISPR/Cas9-BR基因的T0代水稻植株。提取轉基因水稻植株的DNA，進行PCR擴增和測序，與野生型序列進行比對，獲得BR降解相關基因敲除的突變體植株，為突變體遺傳選育以及了解4個BR降解相關基因在水稻體內的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 基因和載體

試驗BR降解相關的4個同源基因分別為CYP734A2、CYP734A5、CYP734A6和CYP734A4；最終載體PC1300-Cas9（圖1a）和中間載體SK-gRNA（圖1b）。供試水稻品種為水稻中花11。

圖1 試驗所用的載體圖

1.2 引物合成

每個基因設計2個敲除位的引物，如表1所示，正向引物序列加GGCA，反向互補引物序列前加AAAC。

對獲得4個載體的轉基因水稻進行編號，分別是LW23、LW24、LW25和LW26，設計4對引物，如表2所示。

表1 4個BR降解相關的同源基因敲除載體的引物序列

1.3 CRISPR/Cas9敲除載體構建

1.3.1 引物退火和SK-gRNA酶切將8對引物的濃度稀釋到100 μmol/L，前引物和后引物各10 μL混合在一起，放入PCR儀中進行退火[8]。反應條件：95℃ 10 min，85℃ 1 min，75℃ 1 min，65℃ 1 min，55℃ 1 min，45℃ 1 min，35℃ 1 min，25℃ 1 min，最后4℃條件下保存引物。用AarⅠ酶切SK-gRNA載體體系（100 μL），37℃酶切 3 h。

1.3.2 中間載體1和2的構建首先將退火的8對引物分別與酶切后的中間載體SK-gRNA進行連接，構建成8個中間載體1。16℃條件下在PCR儀中運行4 h或者在4℃條件下（冰箱）保存過夜。8個中間載體1分別進行大腸桿菌的轉化、菌液培養及質粒DNA提取。中間載體1分別編號為SKgRNA-A2-a，SKgRNA-A2-b，SKgRNA-A5-a，SKgRNA-A5-b，SKgRNA-A6-a，SKgRNA-A6-b，SKgRNA-A4-a，SKgRNA-A4-b。

表2 轉基因植株突變位點的鑒定引物

用BamHⅠ0.5 μL，KpnⅠ0.5 μL酶切8個中間載體1。將酶切產物進行電泳，電泳條件為96 V，根據目標產物大小設定電泳時間，約40 min，待目標產物跑至膠體一半時即可結束電泳。電泳結束后，將瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統中觀察。

在連接反應體系[10×T4 Buffer 1μL，T4連接酶（ligise）1 μL，膠回收大片段 2 μL，膠回收小片段6 μL]下將酶切產物分別連接成為中間載體2。SKgRNA-A2-a和SKgRNA-A2-b連接產物編號為SKgRNA-A2-ab；SKgRNA-A5-a和 SKgRNA-A5-b連接產物編號為SKgRNA-A5-ab；SKgRNA-A6-a和SKgRNA-A6-b連接產物編號為SKgRNA-A6-ab；SKgRNA-A4-a和SKgRNA-A4-b連接產物編號為SKgRNA-A4-ab。16℃條件下在PCR儀中運行4 h 或者在4℃條件下（冰箱）保存過夜。

1.3.3 終載體的構建先用KpnⅠ和BglⅡ進行4個中間載體2以及最終載體PC1300-Cas9的酶切，回收酶切產物。再用T4連接酶將目的片段與PC1300-Cas9載體連接，將構建好的終載體送去測序公司測序以及酶切驗證。

1.4 CRISPR/Cas9-BR降解相關基因轉化水稻愈傷組織和植株再生

將含有CRISPR/Cas9-BR降解相關基因載體的農桿菌菌液培養過夜，用菌液稀釋培養基R1（N6培養基+B5維生素+500 mg/L脯氨酸+300 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+20 mg/L乙酰丁香酮）至OD值為0.6～0.8，侵染水稻的胚性愈傷組織15 min，期間不停晃動，之后用濾紙吸干多余的菌液，放在鋪有濾紙的共培養培養基R2（N6培養基＋B5維生素+500 mg/L脯氨酸+300 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+4.0 g/Lphytalgel+20 mg/L乙酰丁香酮）上暗培養2 d，培養后的胚性愈傷組織用含有500 mg/L頭孢霉素的無菌水洗2次，用濾紙吸干水分，轉接抗性選擇培養基R3（N6培養基+B5維生素+2 mg/L2.4-D+500 mg/L脯氨酸+300 mg/L水解酪蛋白+500 mg/L谷氨酰胺+30 g/L蔗糖+4.0 g/L phytalgel +500 mg/L頭孢霉素+50 mg/L潮霉素）上篩選3次。每15 d 繼代一次。3輪選擇后挑取抗性愈傷組織系，進行編號，并轉接在分化培養基R4（N6培養基＋B5維生素+ 0.5 mg/L NAA +3 mg/L 6-BA+500 mg/L脯氨酸+300 mg/L水解酪蛋白+500 mg/L谷氨酰胺+30 g/L蔗糖+4.0 g/L phytalgel）上進行分化培養，同時提取抗性愈傷組織系的DNA，進行PCR檢測，統計轉化率。胚性愈傷組織出現的綠點進一步分化出不定芽，待不定芽長到2～3 cm，轉接在生根培養基R5（1/2 N6培養基＋1/2 B5維生素+20 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂）上，待苗長到10 cm，并有大量的根，移栽營養缽成活后，再移至大田成活，收種[9]。

1.5 轉基因水稻植株的突變位點鑒定

轉CRISPR/Cas9-BR降解相關基因的水稻植株，分別編號為LW23，LW24，LW25和LW26。其中，LW23轉入CRISPR/Cas9-A2載體，LW24轉入CRISPR/Cas9-A5載體，LW25轉入CRISPR/Cas9-A6載體，LW26轉入CRISPR/Cas9-A4載體。分別用表2的引物，對每個載體獲得的100株轉基因植株進行PCR擴增，對擴增出的片段測序，將檢測結果與參考序列進行比對，篩選出純合突變體、雜合突變體和野生型。

2 結果與分析

2.1 CRISPR/Cas9-BR敲除載體的酶切驗證

將CRISPR/Cas9-BR終載體中的PC1300-Cas9載體用限制性內切酶KpnⅠ和BamHⅠ進行酶切，將酶切后回收的含有兩個gRNA的基因片段連接到最終載體上。同時，以PC1300-Cas9空載體和中間載體2作為對照。載體PC1300-Cas9的大小約為14 633 bp，雙酶切切掉的片段僅3 bp，所以空載體酶切后在電泳圖上應該只會出現一條大小約為15 000 bp的條帶；中間載體經雙酶切后，會出現兩條條帶，分別為大小約3 000 bp的條帶和含有2個gRNA的大小約1 000 bp的條帶；終載體酶切后，也會出現兩條條帶，分別為大小約15 000 bp的條帶和含有2個gRNA的大小約1 000 bp的條帶。根據凝膠電泳結果（圖2）顯示，說明含有兩段目的序列的基因片段確實連接到終載體中。

圖2 PC1300-Cas9基因終載體酶切驗證圖

2.2 轉CRISPR/Cas9-BR基因水稻植株的PCR檢測結果

4個載體分別轉化水稻中花11的愈傷組織，經過2個月左右，獲得大量的分化綠點。在保證每個載體都能獲得一些突變的前提下，為了減少后續的繼代工作量，針對每個載體選取100株轉基因水稻小苗進行煉苗移栽。從400株轉化植株上取葉片樣本，提取其基因組DNA，分別用對應的引物進行PCR擴增。圖3是LW23部分樣品擴增的結果，共有395個樣本能擴增出對應的條帶。將PCR檢測結果呈陽性的DNA樣本及其相對應的引物送往生物公司進行測序。

圖3 LW23轉基因植株的PCR檢測結果

2.3 轉基因水稻的突變位點鑒定

對395株轉化植株DNA序列的測序結果進行分析，可以統計出轉基因水稻的突變位點，如表3所示，270株為野生型，即兩條染色體和參考序列一致；61株為雜合子，即一條染色體和參考序列一致，另一條發生缺失或插入的突變；64株為突變體，其中39個樣本為雜合突變體，即兩條染色體發了不同的突變（一條缺失，另一條插入），25個樣本為純合突變體，即兩條染色體均發生了相同的突變（都是插入或者缺失）（圖4）。所有材料的平均突變率為16.20%，突變率較高，但是4種材料的第二個位點均沒有發生突變。

從表3中還可以看出，CRISPR/Cas 9系統定向敲除LW26材料CYP734A4基因的效率最高，在100個樣本中，野生體35株，突變體41株，其中包括雜合突變體27株，純合突變體14株。計算出突變率高達41%，純合突變率也高達14%。轉CRISPR/Cas 9-BR降解相關基因LW26這個材料突變率極高，是未來進行突變體表型分析的優秀材料。LW24第一個位點的突變率也很高，總突變率高達23%。

表3 4個材料的轉化情況 （株）

3 討 論

利用CRISPR / Cas9系統定點敲除基因在水稻基因功能研究及育種領域早有應用。Zhang 等[10]在兩個水稻亞種中設計了11個靶序列，在水稻胚性細胞第一次分裂前就有接近半數完成了目的基因的編輯，說明CRISPR / Cas9系統在水稻中的應用非常高效。針對水稻抗除草劑基因BEL，Xu等[11]設計了3個不同的gRNAs，進行基因敲除，結果發現水稻植株的突變效率在2%～16%之間。中科院高彩霞實驗室利用CRISPR/Cas9系統敲除了水稻和小麥2種作物的OsPDS和TaMLO等5個基因[12]，其中，水稻中突變效率為4.0%～9.4%，在T0代獲得了水稻純合pds突變體，表現型為植株矮小并且白化，與預期相符[13]。首次證實CRISPR/Cas9系統能夠用于植物的基因組編輯。Feng等[14]通過偏好性優化原核生物Cas9的密碼子，利用35S啟動子驅動Cas9進行表達，在Cas9的C端添加核定位信號，在水稻上成功的實現了Cas9系統的定點突變；首先，利用OsU6-2啟動子對sgDNA進行驅動，分別構建載體，再通過農桿菌介導法轉化水稻的愈傷組織，最終獲得了水稻的SPP、ROC5與YSA3個基因的定點突變。還有研究表明，利用CRISPR/Cas9系統來轉化水稻的愈傷組織，發現了OsBADH2基因的突變率為7.1%，OsPDS-SP1基因的突變率為9.4%，轉化原生質體之后，有3個水稻基因（OsBADH2、OsMPK2以及Os02g23823）和一個小麥基因TaMLO，它們的突變率為26.5%～38%[15]。總體來看，CRISPR/Cas9系統可以對水稻進行基因序列的無選擇性編輯，有效地提高了研究效率，能夠通過基因序列的準確編輯，更加快速地獲得具有優良性狀的新品種。

圖4 DNA測序發現的突變位點

利用水稻轉基因技術，該研究成功獲得轉CRISPR/Cas9-BR降解相關基因的水稻，其中轉基因材料LW26，基因發生的突變率高達41%，說明利用CRISPR / Cas9成功獲得敲除水稻基因的突變體植株，為未來進行突變體功能驗證提供了材料。對此突變體的試驗預期結果為BR降解相關基因功能喪失，油菜素內酯在水稻體內大量積累。另外，從純合的轉CRISPR/Cas9-BR降解相關基因突變體的表型上看，與野生型發生了一些較為明顯的區別，主要有葉夾角變大，種子變大等。另外，轉CRISPR/Cas9-BR基因突變體水稻在產量相關的表型上的變化，如千粒重、每穗粒重，每株穗數、株高、分蘗數等也是今后表型分析的重點研究方向[16]。

4 結 論

該研究將水稻BR降解相關基因的4個同源基因CYP734A2、CYP734A5、CYP734A6和 CYP734A6分別設置了2個敲除位點，通過限制性內切酶KpnⅠ、BglⅡ和BamHⅠ，進行3次連接反應，2次酶切反應，經過中間載體SK-gRNA，最終將這4個同源基因的靶序列構建到終載體PC1300-Cas9中，用于轉化水稻植株。通過PCR擴增技術結合測序結果分析，在395株PCR檢測呈陽性的水稻轉化植株中，得到25株轉CRISPR/Cas 9-BR基因的純合突變體。同時，篩選到轉CRISPR/Cas 9-BR降解相關基因突變效率極高的水稻材料LW26。得到了14株純合突變體和27株雜合突變體，為下一步進行突變體表型分析提供了有力的理論依據，為今后探究BR基因在水稻中的功能奠定了基礎。

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Rice (Oryza sativa) BR Degradation Related Genes Knockout by CRISPR/Cas9 Technology

YE Zhao-nan1,2，HE Lu1，ZHANG Lin-lin1，LI Fei-fei1，LIU Wen-zhen2
（1. Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin’an 311300, PRC; 2. National Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Fuyang 311400, PRC）

Brassinolide (BR) as a common plant hormone plays an important regulation role in the growth and development of plants, especially in the rice plant type improvement and stress resistance. In this study, CRISPR/Cas9 knockout carriers of four rice BR degradation related genes were constructed, then the carriers of the four genes were transformed into rice (Oryza sativa L.) via Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of rice variety Zhonghua 11 callus, and 395 transgenic plants were obtained after the callus was screened, each carrier with 50 mg/L hygromycin as a screening marker; and PCR product was amplified with the primers on both sides of the target site and sequenced. The results showed that the 395 transgenic plants included 270 plants belonging to wild type, 61 to heterozygote type and 64 to mutant type. Of the 64 mutants, 39 were heterozygous mutants and 25 were homozygous mutants, and the frequency of homozygous mutation is 6.25%. The mutant alleles were found in all the four genes, but the mutation efficiencies of different genes were different; and among them, the mutation frequency of the LW26 transgenic plants was 41%. These transgenic plants could be used as a foundation for the breeding of homozygous progeny and the identification of mutation expression in the future.

rice; BR related gene; CRISPR/Cas9 system; genetic transformation; target site identification

Q943.2

A

1006-060X（2017）09-0001-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.009.001

2017-07-10

國家自然科學基金青年基金（31401461）；2016年浙江農林大學校級教改項目（KG16001）；2017年浙江農林大學學生科研訓練項目（113-2013200060）

葉照楠（1996-），女，浙江臺州市人，本科生，農學專業。

李飛飛，劉文真

（責任編輯：成 平）