絮凝劑對紫云英根瘤菌發酵液絮凝效果的研究

吳湘龍，雷 瀟，易世鳴，劉 歡，孟祥池，劉宇波，曾 奧

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

絮凝劑對紫云英根瘤菌發酵液絮凝效果的研究

吳湘龍，雷 瀟，易世鳴，劉 歡，孟祥池，劉宇波，曾 奧

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

根瘤菌發酵會產生大量的胞外粘液，使發酵液變得十分粘稠，從而嚴重影響發酵液的固液分離。為降低發酵液的菌體收集難度，研究在優化根瘤菌發酵水平的基礎上，選用7種絮凝劑對發酵液進行處理，以絮凝率、蛋白去除率、多糖去除率、上清液菌體含量為指標進行篩選。結果表明：聚合氯化鋁（50 mg/L）絮凝速率最快，蛋白多糖去除率高，但粘壁現象嚴重，上清菌體含量少；而陽離子聚丙烯酰胺（100 mg/L）表現出良好的上清菌體含量以及多糖去除率，且粘壁現象少，最適用于紫云英根瘤菌發酵液多糖去除和菌體的收集。

絮凝劑；紫云英根瘤菌；多糖；絮凝

紫云英為水稻田常用綠肥，能夠增加土壤肥力，改善土壤理化性質，特別是對于近年來稻田土壤出現的一系列問題，紫云英種植都有一定的功效。因此，繼續擴大紫云英推廣面積具有重要意義。與紫云英共生固氮的根瘤菌劑因成本低、不影響環境和固氮效果好，也受到普遍受關注。根瘤菌與豆科植物的共生固氮作用雖在19世紀晚期就已經被科學家所認識，但在我國的推廣應用還不夠，主要還是受制于化學肥料高效方便快捷的沖擊[1-3]。

商業生產根瘤菌劑的質量主要受2個因素的影響，一是發酵水平，另一個是有效活菌數。已有文獻報道，在發酵液中加入豆芽汁能顯著提高發酵水平。這主要是因為豆科植物發芽初期根部能分泌一種類黃酮物質，該物質能夠刺激周圍根瘤菌的生長[4-5]。但研究發現，在發酵液中添加20%的豆芽汁，所需豆芽菜用量的成本已經超過培養基其他部分的整體成本。因此，提高豆芽汁的獲得量，降低發酵成本成為當前首要解決的問題。該研究擬通過煎煮和榨汁2種方法分別獲取豆芽汁，以期提高豆芽汁的得率，為根瘤菌劑的生產節本增效。

菌劑的保存直接影響發酵后的有效活菌數。如果直接用發酵液常溫保存，隨著代謝產物的累積，根瘤菌劑仍是一種季節性產品。該課題組通過去營養化、低氧、滲透壓保護及抑制劑抑制等方法使液體根瘤菌劑常溫保存期能達到9個月（其有效活菌數達2億CFU/mL以上），目前相關技術正在申請專利中。而對于工業生產，去營養化是最困難的一環，由于根瘤菌劑發酵均會產生大量粘液，如果單純用離心或膜分離的方法，其能耗非常大，其成本也不低。根瘤菌不含莢膜，菌劑表面也不存在莢膜多糖，因此根瘤菌本身不具備粘稠性，其發酵液粘稠性主要來自于胞外多糖[6-7]。絮凝分離技術是一種新型的分離純化技術，可用于發酵液的凈化處理。該研究擬采用8種絮凝劑對根瘤菌發酵液進行處理，以期篩選出一種營養物質去除率高、絮凝菌體少，且對菌體無影響的絮凝劑，為紫云英根瘤菌的工業化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株中慢生華葵根瘤菌（Mesorhizobium huakuii）13004#菌株，系中慢生根瘤菌屬，由中國農科院菌種保藏中心引進。

1.1.2 培養基YMA培養基：甘露醇10 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCO30.2 g/L，Rh微量元素液4 mL/L（Rh微量元素液 ：H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L），pH 值 6.8～7.0，豆芽汁1 000 mL。豆芽汁分兩種形式，第一種為煎煮，200 g鮮豆芽加入1 000 mL水煮沸30 min后，紗布過濾；第二種為榨汁，200 g鮮豆芽用壓榨機榨汁，棄芽渣，將榨汁液稀釋至1 000 mL即得，每種設3次平行試驗。種子培養基和計數培養基均為YMA培養基。

1.1.3 供試絮凝劑Al2(SO4)3·18H2O、CaCl2（分析純，西隴化工股份有線公司）；陽離子聚丙烯酰胺（分子量800萬～1 500萬）、聚合氯化鋁（天津市光復精細化工研究所）；Fe2(SO4)3，Na2HPO4·12H2O（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；殼聚糖（分析純，上海博奧生物科技有限公司）。

1.1.4 主要儀器TV-1810型紫外-分光光度計（北京普析通用儀器有線公司）；TGL20M-II型高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；5424R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化、接種、培養和菌數測定將活化好的斜面菌種接入種子培養基，30℃，180 r/min培養18 h。后按1%接種量接入發酵培養基，同種培養條件，48 h后稀釋平板計數。

1.2.2 絮凝試驗根據發酵試驗結果，取菌數最多的發酵液進行絮凝試驗?？紤]到pH值對細菌的影響，故將pH值維持與發酵液一致。根據文獻報道[8-10]，選取各絮凝劑用量：殼聚糖0.03 g/mL；陽離子聚丙烯酰胺0.1 g/mL；聚合氯化鋁0.05 g/mL；Al2(SO4)3·18H2O 2.5 g/mL ；Fe2(SO4)33 g/mL ；Na2HPO4·12H2O 2 g/mL ；CaCl23 g/mL。

1.2.3 絮凝操作取發酵液50 mL于100 mL燒杯中，快速攪拌同時緩慢加入絮凝劑，使其完全混合均勻，然后慢速攪拌10 min，攪拌結束后靜置30 min。絮凝結束后，觀察絮凝效果，同時將絮凝液低速（1 000 r/min）離心2 min，取上清液。

1.2.4 指標測定及方法（1）濾速測定：取上清液用中性濾紙過濾，并測定前2 min的濾液體積，計算濾速。（2）透光率測定：取上清液稀釋10倍，以水為空白對照，在610 nm處測定透光率。（3）多糖含量的測定：取發酵液和絮凝離心分離的上清液采用DNS[11]法分別測定多糖含量，計算多糖去除率：多糖去除率（%）=（1-上清液多糖含量/發酵液多糖含量）×100。（4）蛋白質測定：取發酵液和絮凝離心分離上清液采用考馬斯亮藍法[12]分別測定蛋白質含量，計算蛋白去除率：蛋白去除率（%）=（1-上清液蛋白含量/發酵液蛋白含量）×100。（5）菌體含量測定：取發酵液和絮凝離心分離上清液采用稀釋平板法計數，計算菌體收集率：菌體細胞含量（%）=（上清液菌體數/發酵液菌體數）×100。

1.2.5 抑菌試驗將篩選出的絮凝劑用無菌水配制成絮凝劑使用濃度，經無菌過濾器（0.22 μm）過濾除菌，采用杯碟法進行抑菌活性測定，測定其是否對紫云英根瘤菌有抑制作用。

2 結果與分析

2.1 不同方式獲取的豆芽汁對紫云英根瘤菌發酵水平的影響

從表1可以看出，添加豆芽汁后，根瘤菌的發酵水平得到極顯著提升，其中榨汁組的菌數達百億數量級，如此可觀的發酵水平保證了工業發酵的質量，同時也證實了豆科植物發芽初期能分泌促進周圍根瘤菌大量繁殖的物質。榨汁組與煎煮組的菌數差異也達極顯著水平（P＜0.01），說明榨汁提取優于煎煮提取，更利于根瘤菌發酵，對于節省生產成本具有重要意義。

圖1 不同方式獲取的豆芽汁進行根瘤菌發酵獲得的菌數

2.2 不同絮凝劑對發酵液的絮凝效果

添加絮凝劑后，經表觀觀察，發現陽離子聚丙烯酰胺和聚合氯化鋁2種絮凝劑反應快速，均產生了大量絮凝團；硫酸鐵絮凝劑也產生了少量絮凝團，而其他絮凝劑均未見明顯絮凝反應。聚合氯化鋁產生的絮凝團量最多，但粘壁現象十分嚴重，低轉速離心未能使絮凝團沉積，不利于絮凝團的清洗；而陽離子聚丙烯酰胺粘壁現象少，1 000 r/min離心能使粘壁絮凝團沉積到下層。從表1可以看出，除殼聚糖外，高分子絮凝劑的絮凝效果明顯優于低分子絮凝劑，這可能是因為殼聚糖經攪拌后仍難溶解，致使絮凝速率較慢，從而未表現出絮凝效果；而聚合氯化鋁和陽離子聚丙烯酰胺2種絮凝劑絮凝效果非常明顯，在蛋白去除率、多糖去除率、濾速和透光率方面也均明顯優于其他絮凝劑，尤其是聚合氯化鋁，蛋白去除率和多糖去除率分別達67.4%和84.7%，但其菌體回收率較低，僅37.9%，絮凝的同時也去除了大部分菌體，結合粘壁嚴重這一表觀現象，表明聚合氯化鋁并不適用通過絮凝分離營養物質和菌體。而陽離子聚丙烯酰胺，不但表現出了良好的蛋白去除率（60.7%）和多糖去除率（83.8%），而且具有不錯的菌體回收率（60.3%）。綜上可知，陽離子聚丙烯酰胺最適用于紫云英根瘤菌發酵液的菌體絮凝收集。

表1 不同絮凝劑絮凝效果的比較

2.3 絮凝劑的抑菌試驗

研究的目的是利用絮凝劑絮凝特性來收集微生物，那么保證微生物的存活勢必要對其抑菌性進行驗證。從抑菌試驗結果來看，該濃度的陽離子聚丙烯酰胺對紫云英根瘤菌未表現出明顯的抑制效果。

3 討 論

在發酵產業中，絮凝劑主要用于去除菌體、培養基、蛋白多糖等膠狀物或是色素等，從而獲得小分子代謝產物[13]。而該研究試圖通過絮凝劑收集菌體，從試驗結果來看，雖然絮凝分離對菌體造成一定的損失（陽離子聚丙烯酰胺損失率約40%），但因絮凝劑操作簡單，能耗低，所用藥劑和設備的價格低廉，相對于高速離心分離和高強度的膜分離仍具有成本優勢。

目前關于絮凝劑的絮凝機理還沒有完全弄清楚，現階段被大多數人認可的絮凝機理為靜電吸附理論、架橋絮凝理論或“表面覆蓋”模式。絮凝是一個非常復雜的過程，單一的理論并不能解釋所有現象[14]。陽離子聚丙烯酰胺是一種利用有機單體經化學聚合而成的有機高分子化合物，本身能溶于水，具有電解質行為。其絮凝機理是通過電中和使高分子鏈與多個膠體物質以化學鍵相結合，使用時加上高分子的吸附作用使大膠體顆粒沉降。當pH值為中性時，蛋白質一般帶負電，而多糖也含有大量的陰離子基團，故陽離子聚丙烯酰胺在根瘤菌發酵液中能去除大量的胞外多糖和蛋白質。同時，根瘤菌本身不含莢膜，菌體表面電荷并不強（主要是細胞膜表面的糖蛋白），這可能是陽離子聚丙烯酰胺并未對菌體表現出很強絮凝活性的原因。

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Flocculating Efficiency of Rhizobium astragalus with Flocculants

WU Xiang-long，LEI Xiao，YI Shi-ming，LIU Huan，MENG Xiang-chi，LIU Yu-bo，ZENG Ao
（Hunan Institute of Microbiology, Changsha 410009, PRC）

Rhizobium fermentation produces a large amount of extracellular mucus, so the solid-liquid separation of mucus becomes very difficult. In order to reduce the difficulty in bacteria collection, 7 flocculants were used to treat fermentation broth at an optimized fermentation level and evaluate the flocculation effect through flocculation rate, protein removal rate, polysaccharide removal rate and supernatant microorganisms content in this study. The results showed that aluminium polychlorid had the highest flocculation rate, high protein removal rate and polysaccharide removal rate, but a low supernatant microorganisms content with the serious phenomenon of adhering to wall; and cationic polyacrylamide performed a good effect of supernatant microorganisms content and polysaccharide removal rate, with a little wall-adhering phenomenon. In summary, the cationic polyacrylamide was the most suitable flocculant to Rhizobium astragalus for the solid-liquid separation of mucus.

Rhizobium astragalus; flocculant; polysaccharide; flocculation

Q939.114

A

1006-060X（2017）09-0010-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.009.003

2017-07-18

國家自然科學基金（31501698）

吳湘龍（1976-），男，廣東揭陽市人，初級農藝師，主要從事農業微生物研究。

曾 奧

（責任編輯：成 平）