響應面法優化鱈魚碎肉水解工藝

張明貴 ，趙 玲 ，劉 淇 ，魏玉西

（1.青島大學生命科學學院，山東 青島 266071；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071）

響應面法優化鱈魚碎肉水解工藝

張明貴1, 2，趙 玲2，劉 淇2，魏玉西1

（1.青島大學生命科學學院，山東 青島 266071；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071）

為探索出鱈魚碎肉的最佳水解工藝條件，以鱈魚碎肉多肽得率為評價指標，考察水解溫度、水解時間、pH值、加酶量和料液比對多肽得率的影響，在此基礎上根據Box-Behnken中心組合試驗設計優化水解工藝，建立多肽得率與各響應因子的回歸方程。結果表明：各因素對多肽得率的影響強弱順序為pH值＞溫度＞加酶量，鱈魚碎肉水解的最佳工藝條件為水解溫度55.6℃，pH值8.2，加酶量3 250 U/g，在此條件下多肽得率可達31.02%。

鱈魚；響應面法；水解工藝；優化

向海洋索取食物、功能蛋白和特殊活性物質，已成為世界各沿海國家海洋開發的一項重要內容[1]。海洋生物量約占全球生物總量的一半，其中蘊含了大量的生物活性物質，尤其是海洋生物的蛋白質是制備生物活性肽的理想材料[2]。種類繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潛在著許多具有生物活性的多肽片段，用特異的蛋白酶水解，就能將這些肽段釋放出來。因此，采用生物技術方法對水產品加工副產物蛋白進行水解活性肽的高值化開發，具有良好的發展前景。

真鱈魚（Gadus macrocephalus）是我國重要的大型冷水性海洋經濟魚種之一，年加工量高達40×104～50×104t[3]，在加工過程中產生的魚頭、魚皮、魚骨、碎肉等副產物約占總量的30%～40%。國內外學者對鱈魚加工副產物進行了大量的研究，例如：分別從鱈魚皮和鱈魚骨中提取膠原蛋白，并進行抗氧化活性的測定，為制備天然、安全的抗氧化因子提供支持[4-5]；從鱈魚排中分離出免疫活性肽，可明顯促進脾細胞和T細胞增殖及巨噬細胞吞噬作用[6]；從鱈魚排中成功分離得到對鈣具有高親和力的寡肽[7]；通過酶解鱈魚皮成功制備具有血管緊張素轉換酶抑制劑活性的降血壓肽[8]。然而，鱈魚碎肉目前尚未得到有效的開發利用，有關鱈魚碎肉蛋白水解方面的研究也較少。大分子蛋白經酶解后，更有利于后續的加工利用。筆者以鱈魚碎肉為原料，通過響應面法優化多肽的制備工藝，以期為鱈魚碎肉的高值化利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試鱈魚碎肉購自煙臺嘉惠海洋生物科技有限公司。剔除其中的魚鱗、魚鰭和魚皮，65℃烘干，粉碎后過60目篩，收集粉末；加入異丙醇（m︰V=1︰4）脫脂后，真空抽濾，殘渣75℃烘干，得到脫脂魚粉。

供試酶AP-1由中國水產科學研究院黃海水產研究所海洋食品工程實驗室自制。從刺參腸道中篩選得到的一株產堿性蛋白酶的海洋細菌（該菌株16sRNA序列經過分析比對后，初步判斷其為奈瑟氏球菌科不動桿菌屬，相似度為99%），以其為菌種發酵，獲得酶AP-1，酶活為50 000 U/g。

試驗主要試劑有牛血清白蛋白標準品（sigma公司），磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、碘化鉀、甲基紅、甲基藍、無水乙醇和石油醚（國藥集團化學試劑有限公司）；硫酸和鹽酸（萊陽經濟技術開發區精細化工廠）；硼酸（天津博迪化工股份有限公司）。

主要儀器設備有AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、SXL-1016型馬弗爐（上海精宏實驗設備有限公司）、LTKC-B1-T型數顯恒溫振蕩器（國華電器有限公司）、 5804R離心機（Eppendorf有限公司）、ST310脂肪抽提器（Foss有限公司）、HH-2數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、UV-2082型紫外可見分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）、PB-10型pH計（Sartorius公司）、DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）和K1100全自動凱氏定氮儀（濟南海能儀器股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 基本成分的測定水分含量參照GB5009.3—2016，采用直接干燥法測定；灰分含量參照GB5009.4—2016，采用高溫灼燒法測定；蛋白質含量參照GB5009.5—2016，采用凱氏定氮法測定；粗脂肪含量參照GB5009.6—2016，采用索氏抽提法測定。

1.2.2 多肽濃度標準曲線的制作參照文獻[9-10]以牛血清白蛋白濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 鱈魚多肽的制備取鱈魚粉（精確到0.01 g）配制成0.02 g/mL的鱈魚粉溶液，加入酶AP-1 （精確到0.001 g），用1 mol/L NaOH溶液調節pH值，于恒溫振蕩水浴鍋中酶解，每10 min校正一次pH值。 酶解完成后，沸水浴滅活5 min，10 000 r/min離心20 min，取上清液，雙縮脲法測定上清液的多肽濃度[11]。根據公式（1）計算多肽得率[12]：

式中，η為多肽的理論得率（%），C為多肽濃度（mg/mL），V為多肽溶液的體積（mL），M為鱈魚粉的質量（g）。

1.2.4 單因素試驗以多肽得率為評價指標，考察水解溫度（30、40、45、50、55、60℃）、水解時間（1、2、3、4、5、6 h）、pH 值（6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、加酶量（1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 、3 500 U/g）和料液比（1︰30、1︰40、1︰50、1︰60、1︰70、1︰80）5個因素對水解效果的影響。單因素試驗過程中其他設定條件分別為：水解溫度50℃，水解時間3 h，pH值8.0，加酶量2 500 U/g，料液比1︰50，每個試驗重復3次，多肽得率為3次結果的平均值。

1.2.5 響應面設計根據 Box-Behnken中心組合設計原理[13]，在單因素試驗結果基礎上，以多肽得率為響應值，運用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行響應面試驗設計。每一個自變量按低、中、高3個水平分別以-1，0，1進行編碼，進行3因素3水平響應面試驗，試驗設計如表1所示。

表 1 響應面設計的因素與水平

1.2.6 數據分析運用Design- Expert V8.0.6.1軟件分析數據，采用F檢驗對數據進行方差分析以評價模型的統計意義，獲得回歸模型及響應面圖，對水解工藝參數進行優化，并對優化結果進行3次平行試驗，以驗證模型的可行性。

2 結果與分析

2.1 鱈魚碎肉的基本成分

經測定，鱈魚碎肉中蛋白質、灰分、粗脂肪和水分的含量分別為18.71%、0.80%、0.46%和80.10%。

2.2 牛血清白蛋白標準曲線

牛血清白蛋白標準曲線如圖1所示，牛血清白蛋白濃度在0～5.0 mg范圍內與吸光度值呈現良好的線性關系，回歸方程為y=0.115 2x-0.002 1，R2=0.999 8。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線

2.3 單因素試驗結果

由圖2至圖6可知，在單因素試驗條件下，鱈魚碎肉水解的適宜條件如下：水解溫度55℃左右，水解時間5 h左右，pH值8.0左右，適宜的加酶量為3 000 U/g原料左右，料液比為1︰40左右。

2.4 響應面試驗結果與分析

如表2所示，Box-Behnken設計共有17個試驗，其中13個為析因試驗，其余4個為中心試驗，析因點為自變量取值所構成的三維定點，零點區域為中心點，零點區域重復4次，用于估計試驗誤差。利用Design-Expert V8.0.6.1分析表3試驗數據，結果見表4。通過二次多元回歸擬合，得到蛋白酶水解鱈魚碎肉的回歸方程為：η=30.45+0.51A+1.36B+0.45C-0.063AB+0.12AC+0.055BC-1.38A2-2.63B2-0.27C2。

圖2 溫度對多肽得率的影響

圖3 時間對多肽得率的影響

圖4 pH值對多肽得率的影響

圖5 加酶量對多肽得率的影響

圖6 料液比對多肽得率的影響

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

由表3可以看出，回歸方程F值為34.45，表明模型因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05）；試驗中一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2對多肽得率的影響均達顯著或極顯著水平，而交互項對多肽得率的影響不顯著，表明在水解過程中，各個因素對多肽得率的影響不是簡單的線性關系[14]，其中水解溫度、pH值和加酶量對多肽得率有顯著的影響，各因素之間的交互作用對其沒有顯著影響。

由統計學計算出的模型總回歸的相關性系數R2=0.977 9，自變量與響應值之間線性關系顯著可用于該反應的理論推測；說明它能解釋94.95%的相應值變化，僅有5.05%的相應值不能用該模型解釋；殘差、純誤差都比較小，變異系數為1.06%，信噪比為17.975（＞4），說明可信度比較高，精確性良好，可用于指導模型[15]。由P檢驗可得各因素對多肽得率的影響強弱順序為pH值＞水解溫度＞加酶量。

在水解溫度、pH值和加酶量3個因素中，由圖7可知，pH值對多肽得率的影響最大，表現為曲面較陡，沿pH值軸方向，多肽得率變化范圍較大；由圖8可知，水解溫度對多肽得率的影響較大，表現為曲面較陡，沿溫度的軸方向，多肽得率變化范圍較大；由圖9可知，加酶量對多肽得率的影響較小，沿料液比的軸方向，多肽得率較小。響應面法獲得的結果與方差分析獲得的結果相吻合[16]。

表3 模型方差分析表

響應面優化回歸模型結果表明，當水解溫度為55.61℃，pH值為8.22，加酶量為3 250 U/g時，理論上多肽得率為30.796 1%。為了試驗操作便利，將優化得到的工藝條件修正為水解溫度55.6℃，pH值 8.2，加酶量3 250 U/g。在此修正條件下，進行3次平行試驗，得到多肽得率為（31.02±0.36）%，說明該模型適宜對鱈魚碎肉水解工藝進行分析和預測。

3 結 論

試驗通過響應面法優化鱈魚碎肉水解工藝，得到最佳工藝條件為：水解溫度55.6℃，pH值8.2，加酶量3 250 U/g，在此最優條件下，制備的鱈魚碎肉多肽得率可達31.02%，與理論預測值基本一致。這表明試驗建立的響應面模型可用于預測鱈魚碎肉的酶促水解過程，對于相關產品的開發和生產具有一定的參考價值。

圖7 水解溫度與pH值對多肽得率影響的響應面圖和等高線圖

圖8 水解溫度與加酶量對多肽得率影響的響應面圖和等高線圖

圖9 pH值與加酶量對多肽得率影響的響應面圖和等高線圖

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Optimization of Hydrolysis Conditions of Codfish Minced Meat by Response Surface Methodology

ZHANG Ming-gui1,2，ZHAO Ling2，LIU Qi2，WEI Yu-xi1
（1. College of Life Science, Qingdao University, Qingdao 266071, PRC; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Science, Qingdao 266071, PRC）

In order to explore the optimal hydrolysis conditions for codfish minced meat, the effect of single factors such as temperature,time, pH, dosage of enzyme and material liquid ratio on the yield of polypeptides was analyzed; and Box-Behnken central composite design was carried out to optimize the hydrolysis process and a quadratic regression model was established on the polypeptide rate and response factors in this study. The results showed that the influence of single factors on the yield of polypeptides was that of pH＞ that of temperature＞ that of enzyme dosage, respectively. The optimal hydrolysis conditions were the temperature at 55.6 ℃ , the pH at 8.2, and the enzyme dosage at 3 250 U/g, under which the yield of polypeptides could be 31.02%.

codfish; response surface methodology; hydrolysis process; optimization

TQ925+.2

A

1006-060X（2017）09-0084-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.009.021

2017-07-05

中國水產科學研究院基本科研業務費（2016HY-ZD1002）

張明貴（1991-），男，山東德州市人，碩士研究生，研究方向為海洋微生物資源的開發與利用。

劉 淇

（責任編輯：成 平）