支架蛋白RACK1與蛋白激酶WEE1互作調控胃癌細胞株HGC27增殖的作用研究

任麗莉　劉超　王一曌

[摘要] 目的 研究活化的蛋白激酶C受體（Receptor for activated protein kinase C，RACK1）與蛋白激酶WEE1互作調控胃癌細胞株HGC27生長增殖及其作用機制。 方法 采用LipofectAMINE 2000在HGC27細胞中過表達RACK1，Western blotting檢測HGC27細胞中WEE1蛋白表達；免疫共沉淀驗證RACK1和WEE1在HGC27細胞內存在相互作用；細胞內免疫熒光觀測RACK1與WEE1在HGC27細胞中的表達定位情況。 結果 過表達RACK1后WEE1在胃癌細胞HGC27中的表達降低，RACK1與WEE1在HGC27細胞內存在相互作用且共定位在細胞質內。結論 RACK1與WEE1共同作用調控胃癌的發生發展過程，為RACK1成為臨床上胃癌治療的潛在靶點提供理論基礎和實驗依據。

[關鍵詞] 活化的蛋白激酶C受體；WEE1；胃癌；HGC27細胞

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）23-0029-04

[Abstract] Objective To study the regulatory role of the interaction of scaffolding protein RACK1 with protein kinase WEE1 in the proliferation of gastric cancer cell line HGC27 and the mechanism. Methods RACK1 was overexpressed in HGC27 cells by LipofectAMINE 2000. Western blotting was used to detect the expression of WEE1 protein in HGC27 cells. Immunoprecipitation showed that RACK1 interacted with WEE1 in HGC27 cells. Immunofluorescence was used to observe the expression and positioning of RACK1 and WEE1 in HGC27 cells. Results After expression of RACK1， the expression of WEE1 in gastric cancer cells HGC27 was decreased， and RACK1 interacted with WEE1 in HGC27 cells， and they co-localized in cytoplasm. Conclusion The interaction of RACK1 with WEE1 regulates the development and progression of gastric cancer， and it provides the theoretical basis and experimental basis for RACK1 to be a potential target for clinical treatment of gastric cancer.

[Key words] Activated protein kinase C receptor； WEE1； Gastric cancer； HGC27 cells

胃癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一，在中國胃癌發病率位于惡性腫瘤第二名。尤其在中國的農村地區，更位于各種惡性腫瘤之首[1]。因此，對胃癌進行早期診斷和治療十分必要。所以，尋找胃癌的分子標記物對研究胃癌發生發展就顯得非常有意義。活化的蛋白激酶C受體（Receptor for activated protein kinase C，RACK1）作為支架蛋白，可介導多種蛋白的性質和功能。如和激活的PKC相互作用，調節其在細胞內定位；作為JNK或HIF1α的錨定蛋白，調節其蛋白的穩定性；和核糖體蛋白相互作用，調節細胞內蛋白的翻譯；結合并整合多種信號通路的蛋白分子，調節哺乳動物的發育[2]。因而RACK1可調節體內各種生物學過程，包括信號傳導、免疫應答、細胞生長、遷移和分化以及MAPK活化、血管生成、腫瘤生長、神經元反應、細胞凋亡、染色質重塑和生物鐘的正常功能[3-6]。最近研究表明，RACK1在細胞周期進程中起著重要調節作用，因而備受大家關注。酵母（S.pombe）遺傳學分析表明，RACK1/Cpc2調控細胞周期進程進而調節減數分裂，RACK1/Cpc2負調控WEE1蛋白水平進而正調控有絲分裂的進程[7]。很多研究證實，腫瘤的發生發展過程與RACK1在細胞內的表達水平高低有著密切的聯系，例如RACK1可通過激活蛋白激酶C（PKC）進而促進腫瘤細胞的侵襲轉移[8]；相關研究已表明RACK1在乳腺癌、肺癌、宮頸癌、口腔鱗癌、腸癌等多種腫瘤組織中高表達，并跟腫瘤的分期和預后有著密切的相關性[9]。雖然RACK1的高表達已經在其他多種癌組織中被證實，但RACK1在胃癌中的表達情況及其對預后的影響還不清楚。本研究旨在通過過表達RACK1蛋白后檢測蛋白激酶WEE1的表達情況，并采用免疫共沉淀和免疫熒光方法檢測RACK1與WEE1在胃癌細胞中的定位與相互作用，進而分析RACK1與WEE1共同作用調控胃癌的發生發展，從而為RACK1作為胃癌臨床治療的靶點提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

胃癌細胞株HGC-27由中國醫科大學李豐教授惠贈。重組質粒pcDNA3.1A-flag-rack1由本實驗室構建保存。LipofectAMINE 2000（Invitrogen公司，美國），Protein A/G Plus beads（Santa Cruz公司，美國），RACK1抗體（BD公司，美國），WEE1抗體（Abcam公司，美國），FITC和TRITC標記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物公司），HRP標記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗，RIPA Buffer Western細胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑及BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發光試劑盒（北京碧云天生物公司）。BB16UV CO2培養箱（德國Heraeus），水浴式電轉印槽DYY-Ⅲ 40B型（北京六一儀器廠），凝膠自動成像儀（UVP，美國），電泳儀及電泳槽（Bio-Rad公司，美國），激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica公司，德國）。endprint

1.2 HGC27細胞培養和轉染

HGC27細胞生長于含有10%滅活胎牛血清的1640培養基中（含有100 U/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素），37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。質粒轉染按照Lipo 2000轉染試劑說明書進行操作。實驗分為未處理組、pcDNA3.1空載體轉染組、pcDNA3.1A-flag-RACK1質粒轉染組三組。細胞培養48 h后收集，進行后續實驗。

1.3 Western-blotting檢測HGC27細胞中WEE1蛋白表達

收集并提取各組細胞總蛋白，測蛋白濃度后煮沸，冷卻離心，10% SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，3%BSA的TBS（pH7.4）封閉2 h，分別與anti-WEE1抗體（1∶500稀釋）和β-Actin（1∶1000稀釋）4℃過夜溫育。TTBS洗膜3次，HRP偶聯的山羊抗鼠IgG（1∶5000稀釋）室溫溫育2 h，洗膜3次，ECL發光法進行顯色，實驗重復3次。

1.4 免疫共沉淀驗證在HGC27細胞內RACK1和WEE1存在相互作用

收集培養48 h后HGC27細胞，加入預冷的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑）離心后，取上清進行蛋白定量，取等量蛋白沉淀煮沸，-20℃保存。取適量預冷混懸的蛋白A/G瓊脂糖珠子，加入細胞上清液孵育后離心，取上清，一部分加入l μg RACK1抗體，另一部分加入1 μg IgG后，4℃孵育2 h后，加蛋白A/G瓊脂糖珠子繼續孵育過夜，離心棄上清，PBS清洗剩余的珠子后離心，重復5次，保留沉淀，煮沸，離心，取上清進行SDS-PAGE電泳和轉膜，以下方法同1.4，實驗重復2次。

1.5 細胞間接免疫熒光觀察HGC27細胞RACK1和WEE1共定位情況

接種適量HGC27細胞于6孔培養板中，內放蓋玻片，培養48 h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，PBS清洗3次，0.2%TritonX-100打孔，1%BSA室溫封閉l h，PBS清洗3次，RACK1和WEE1抗體4℃過夜，PBS洗滌清洗，FITC和TRITC標記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG（1∶100）37℃避光孵育45 min，PBS清洗后，加DAPI室溫復染細胞核10 min，甘油封片后，激光共聚焦顯微鏡下觀察、成像。本組實驗重復2次。

1.6 統計學方法

應用Graphpad prism 5統計學軟件進行數據統計分析，WEE1蛋白表達量的變化情況以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。每組實驗重復2～3次。

2 結果

2.1 過表達RACK1后WEE1在胃癌細胞HGC27中表達降低

轉染后提取蛋白進行免疫印跡檢測，與未轉染組（0.35±0.06）的蛋白表達量相比，pcDNA3.1空載轉染組WEE1的蛋白表達量（0.38±0.07）無明顯區別，pcDNA3.1-flag-Rack1轉染組WEE1蛋白表達量（0.14±0.02）明顯降低，經統計分析，差異有統計學意義（P<0.05）。見封三圖6。

2.2 免疫共沉淀證實RACK1與WEE1在胃癌細胞HGC27內存在相互作用

HGC27細胞裂解提取蛋白，加入beads與RACK1抗體共孵育后，洗脫beads結合的蛋白，再用WEE1抗體進行免疫沉淀檢測，結果Input組與IP組在90 kDa附近檢測到條帶，IgG組沒有檢測到條帶，并且IP組Wee1蛋白的表達量明顯低于Input組。見封三圖7。

2.3 免疫熒光檢測RACK1與WEE1在胃癌細胞HGC27中共定位

細胞用相應抗體標記后，熒光顯微鏡觀察，RACKI與WEE1主要共定位于HGC27細胞的胞質內。見封三圖8。

3 討論

支架蛋白RACK1是因為與有活性的蛋白激酶C（PKC β Ⅱ）相互作用而得名，具有七個螺旋槳結構的Trp-Asp（WD）重復序列，與G蛋白β亞單位具有同源性，又名GNB2L1[guanine nucleotide binding protein（G protein），beta polypeptide 2-like 1]，在真核生物間高度保守[10]。RACK1是細胞內的穿梭蛋白，可位于胞漿、線粒體、內質網和細胞核內。RACK1可通過與PKC結合調控核糖體翻譯，來促進與侵襲轉移相關因子表達。實驗室前期的實驗結果已表明，RACK1在胃癌組織中的表達水平要明顯低于癌旁組織，且與胃癌分期緊密相關[11]，RACK1的mRNA及蛋白在胃癌細胞HGC27中的表達顯著低于正常胃黏膜細胞GESY，過表達RACK1可明顯抑制HGC27細胞生長增殖。

為探討RACK1表達上調抑制胃癌細胞生長和增殖的可能機制，本研究首先通過Western bloting檢測在HGC27細胞中過表達RACK1后細胞周期蛋白WEE1的表達水平，結果發現轉染組WEE1的表達水平明顯降低，顯著低于未轉染組和空載對照組。MPF是細胞周期中極其關鍵的調節因子。在細胞分裂間期，直到G2期結束時，WEE1蛋白激酶可通過磷酸化MPF的重要組分-Cdc2上的Thr14和Tyr15殘基使MPF處于失活狀態。WEE1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與末端磷酸化，還可失活細胞周期蛋白依賴性激酶1（Cyclin dependent kinase 1，CDK1），從而導致DNA損傷應答而阻滯G2期細胞周期，負性調控細胞有絲分裂的進行[12]。有研究發現，WEE1在惡性黑色素瘤、乳腺癌、骨肉瘤和神經膠質瘤等一些腫瘤中高表達[13-16]，但在胃癌中如何表達還不清楚。

目前僅有Kim HY等[12]報道WEE1在胃癌組織中高表達且與伴有淋巴結轉移的男性胃癌患者不良預后密切相關，同時檢測WEE1在12種胃癌細胞株中的表達，7株高表達，5株表達很少或不表達，文中沒有檢測WEE1在HGC27細胞中的表達情況。實驗室前期的研究中已發現WEE1在HGC27細胞中的表達水平要明顯低于正常胃黏膜細胞GESY，本研究中過表達RACK1抑制WEE1蛋白的表達，具體的機制還不清楚。正常細胞修復損傷的DNA主要在G1期阻滯，然而癌細胞經常在G1期阻滯有缺陷，很大程度上取決于G2期阻滯，因此，與正常細胞相比，癌細胞在G2期檢查點增加了DNA損傷的程度[12]，本研究中在HGC27細胞中過表達RACK1可能破壞了G2/M期檢查點的平衡，抑制了細胞增殖。既然RACK1的改變影響了WEE1蛋白的表達，兩者是如何相互作用的呢？我們又應用免疫共沉淀實驗來驗證在胃癌HGC27細胞中RACK1與WEE1存在相互作用。endprint

為了進一步研究RACK1與WEE1在胃癌細胞中的關系，我們進行了免疫熒光共定位觀察到了這兩個蛋白在胃癌的亞細胞結構中的共定位情況，證實二者共定位于HGC27細胞胞質中。這些實驗結果充分說明RACK1與WEE1在胃癌細胞HGC27中能夠共定位，有著十分緊密的互作關系，對胃癌的發生發展有著一定的影響作用。由此可推測，RACK1與WEE1在細胞中的相互作用可能是調控胃癌細胞生長增殖的主要機制之一。但RACK1與WEE1是如何互作以及如何調控胃癌發生的具體機制還需進一步的研究探討。

[參考文獻]

[1] Badgwell B.Multimodality Therapy of localized gastric adenocarcinoma[J]. J Natl Compr Canc Netw，2016，14（10）：1321-1327.

[2] Choi YY，Lee SY，Lee WK，et al.RACK1 is a candidate gene associated with the prognosis of patients with early stage non-small cell lung cancer[J].Oncotarget，2015，6（6）：4451-4466.

[3] Cheng D，Zhu X，Barchiesi F，et al.Receptor for activated protein kinase C1 regulates cell proliferation by modulating calcium signaling[J]. Hypertension，2011，58（4）：689-695.

[4] Wang F，Osawa T，Tsuchida R，et al.Downregulation of receptor for activated C-kinase 1（RACK1）suppresses tumor growth by inhibiting tumor cell proliferation and tumor-associated angiogenesis[J]. Cancer Sci，2011，102（11）：2007-2013.

[5] Shi S，Deng YZ，Zhao JS，et al.RACK1 promotes non-small-cell lung cancer tumorigenicity through activating sonic hedgehog signaling pathway[J].J Biol Chem，2012， 287（11）：7845-7858.

[6] Robles MS，Boyault C，Knutti D，et al.Identification of RACK1 and protein kinase C alpha as integral components of the mammalian circadian clock[J]. Science，2010， 327（5964）：463-646.

[7] Núnez A，Franco A，Soto T，et al.Fission yeast receptor of activated C kinase（RACK1） ortholog Cpc2 regulates mitotic commitment through Wee1 kinase[J].J Biol Chem，2010，285（53）：41366-41373.

[8] Grosso S，Volta V，Sala LA，et al. PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1[J].Biochem J，2008，415（1）：77-85.

[9] Chen L，Min L，Wang X，et al. Loss of RACK1 promotes metastasis of gastric cancer by inducing a miR-302c/IL8 signaling loop[J]. Cancer Res，2015，75（18）：3832-3841.

[10] Deng YZ，Yao F，Li JJ，et al.RACK1 suppresses gastric tumorigenesis by stabilizing the β-catenin destruction complex[J].Gastroenterology，2012，142（4）：812-823.

[11] 王一曌，郭琳，劉乙蒙，等.Rack1與β-catenin在胃癌組織中的表達與臨床意義[J].中國生化藥物雜志，2016， 36（3）：1005-1008.

[12] Kim HY，Cho Y，Kang H，et al.Targeting the WEE1 kinase as a molecular targeted therapy for gastric cancer[J].Oncotarget，2016，7（31）：49903-49916.

[13] Mueller S，Hashizume R，Yang X，et al.Targeting Wee1 for the treatment of pediatric high-grade gliomas[J].Neurooncology，2014，16（3）：352-360.

[14] Magnussen GI，Holm R，Emilsen E，et al.High expression of Wee1 is associated with poor disease-free survival in malignant melanoma：Potential for targeted therapy[J]. PloS one，2012，7（6）：e38254.

[15] Kreahling JM，Foroutan P，Reed D，et al.Wee1 inhibition by MK-1775 leads to tumor inhibition and enhances efficacy of gemcitabine in human sarcomas[J]. PloS one， 2013，8（3）：e57523.

[16] Murrow LM，Garimella SV，Jones TL，et al.Identification of WEE1 as a potential molecular target in cancer cells by RNAi screening of the human tyrosine kinome[J]. Breast Cancer Res Treat，2010，122（2）：347-357.

（收稿日期：2017-05-06）endprint