蘆薈中1個具有抗菌活性的多取代基萘類新化合物

孔維松+李晶+劉欣+米其利+陳建華+李雪梅+楊光宇+胡秋芬+李濤+楊葉昆

[摘要] 對庫拉索蘆薈的化學成分進行研究。運用硅膠、凝膠、MCI-gel 樹脂及 RP-HPLC 等多種色譜技術從庫拉索蘆薈70%乙醇提取物中分離鑒定了1個多取代基萘類化合物，該化合物鑒定為3-羥基-1-（1，7-二羥基 -3，6-二甲氧基萘 -2-基）-1-丙酮 （1）。生物活性測試表明，其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株的MIC90為（48±4） mg·L-1，小于左氧氟沙星的MIC90（58±5） mg·L-1，具有突出的抗菌活性。

[關鍵詞] 蘆薈； 多取代基萘； 抗菌活性

[Abstract] A new naphthalene derivative has been isolated from Aloe vera by using various chromatographic techniques， including silica gel， sephadex， MCI-gel resin， and RP-HPLC. The new compound was determined as 3-hydroxy-1-（1，7-dihydroxy-3，6-dimethoxynaphthalen-2-yl）propan-1-one （1）. In the biological activity assay， compound 1 disglayed prominent antibacterial activity with a MIC90 value of （48±4） mg·L-1 for methicillin resistant Staphylococcus aureus （MRSA） strain which was stronger than that of the positive control levofloxacin with a MIC90 value （58±5） mg·L-1.

[Key words] Aloe vera； naphthalene derivative； antibacterial activity

蘆薈為百合科蘆薈屬多年生常綠草本植物，原產于地中海、非洲，因其易于栽種，為花葉兼備的觀賞植物，頗受大眾喜愛。據考證野生蘆薈品種有300多種，有藥用價值的蘆薈品種主要有：洋蘆薈，庫拉索蘆薈，好望角蘆薈，元江蘆薈等。蘆薈是集食用、藥用、美容、觀賞于一身植物^[1]。其泌出物（主要有效成分是蘆薈素等蔥醌類物質）已廣泛應用到醫藥和日化中。蘆薈酊是抗菌性很強的物質，能殺滅多種真菌、霉菌、細菌、病毒等病菌，抑制和消滅病原體的發育繁殖^[2]。研究表明蘆薈中發現的化學成分已達160多種，其有效活性成分達 100 種以上。蘆薈中主要活性成分有蒽醌、吡喃酮、色酮、萘類衍生物、多糖類、黃酮等，這些有效成分具有抗菌、抗炎、解熱、保肝、抗癌、殺蟲及免疫增強等多方面的功用^[3]。為了從蘆薈中發現更多的活性化學成分，本實驗對產自云南元江的庫拉索蘆薈Aloe vera （L.） Burm. f.進行了化學成分研究，并從中分離到1個新的多取代基萘類化合物，該化合物具有顯著的抗菌活性。

1 材料

UV-2401A 紫外光譜儀 （日本島津公司）；Bio-Rad FTS-185 傅里葉變換紅外光譜儀 （美國伯樂BIO-RAD公司）；DRX-500 型核磁共振儀 （瑞士布魯克公司）；API QSTAR 飛行時間質譜 （美國應用生物公司），VG Autospec-3000高分辨質譜 （英國質譜儀器公司），半制備 HPLC 分析儀器為島津 LC-8A 型高效液相色譜儀，色譜柱為安捷倫公司 Zorbax PrepHT GF （21.2 mm×250 mm，7 μm） 和安捷倫 Zorbax C18 （9.4 mm×250 mm，5 μm）。柱色譜硅膠 （80～100，150～200 目）、GF254 （100 mm×100 mm） 硅膠板，均為青島海洋化工廠生產；MCI 填充材料為 MCI-gel CHP-20P （75～150 μm），購于日本三棱公司；凝膠為 Sephadex LH-20，購于安瑪西亞生物技術（上海）有限公司；薄層色譜法顯色，顯色劑為 5% H2SO4乙醇溶液，噴灑后適當加熱即可；工業用二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯。

實驗樣品為庫拉索蘆薈，拉丁名A. vera，2016年 10 月采于云南元江縣，取蘆薈地上部分曬干供隨后的提取和分離用。標本經云南民族大學民族醫藥學院楊青松教授鑒定，標本 （No.2016089） 保存于云南民族大學民族藥資源化學重點實驗室標本館。

2 提取與分離

取干燥的蘆薈樣品2.5 kg 粉碎到30 目，然后用70% 乙醇水溶液提取 4 次，每次用量為 3.5 L，室溫浸泡、超聲 4次 （每次 30 min），濾過，合并提取液，提取物濃縮到小體積后用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯相減壓濃縮得浸膏26.8 g。浸膏用30 g 粗硅膠 （80～100 目） 拌樣，烘干，用250 g硅膠 （150～200目） 柱色譜，二氯甲烷-丙酮 （20∶1，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5） 梯度洗脫，分成 6 個部分。將二氯甲烷-丙酮（7∶3）洗脫部分用甲醇溶解，采用 Agilent 公司的 Zorbax PrepHT GF （21.2 mm ×250 mm，7 μm） 反相柱，以48%甲醇水溶液為流動相，體積流量為20 mL·min-1，收集32.8 min 的色譜峰，得化合物粗品。粗品再以甲醇為流動相，用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 柱色譜凈化可得化合物1的純品25.8 mg（圖1）。

3 結構鑒定

化合物1為橙紅色膠狀物，其高分辨質譜HR-ESI-MS （正離子采集） 顯示準分子離子峰為 m/z 315.085 2[M+Na]+，（計算值315.084 5）。結合1H 和13C-NMR譜確定化合物分子式為C15H16O6，不飽和度為8。紅外光譜中顯示了羥基（3 425 cm-1）、羰基 （1 682 cm-1） 和芳環 （1 618，1 542，1 441 cm-1） 的共振吸收峰。紫外光譜在 215，260，332 nm 有最大吸收證實化合物中存在芳環結構。化合物的1H，13C-NMR和DEPT數據 （表1） 顯示化合物中存在16個碳和16個氫，包括1個1，2，3，6，7-五取代的萘母核^[4] （C-1～C-8，C-4a和C-8a；H-4，H-5和H-8），1個3-羥基-1-丙酮基^[5] （C-1′～C-3′；H2-2′和H2-3′），2個甲氧基 （δC 56.0 q，56.3 q；δH 3.80 s，3.83 s），以及2個酚羥基 （δH 12.74，11.28）。1，2，3，6，7-四取代的萘母核可進一步由H-4和C-2、C-3、C-4a、C-8a、C-5，H-5和C-4、C-6、C-7、C-4a、C-8a，以及H-8和C-1、C-6、C-7、C-4a、C-8a的HMBC相關（圖2）得到確認。進一步分析其HMBC相關譜，根據2個甲氧基氫 （δH 3.80，3.83） 分別與C-3 （δC 150.1） 和C-6 （δC 154.3）的HMBC相關可推測甲氧基取代在萘母核的C-3和C-6位。2個酚羥基取代在萘母核的C-1和C-7位可由酚羥基氫 （δH 12.74） 和C-1 （δC 167.3）、C-2 （δC 109.3）、C-8a （δC 121.6），以及另一個酚羥基氫 （δH 11.28） 和C-6 （δC 154.3）、C-7 （δC 148.3）、C-8 （δC 105.3）的HMBC相關得到確認。3-羥基-1-丙酮基取代在C-2位可通過H2-2′ （δH 3.33）和C-2 （δC 109.3）的HMBC相關得到確認。萘環上典型的質子信號H-4 （δH 6.43 s）、H-5 （δH 6.94 s）和H-8 （δH 7.62 s）也支持萘母核上的上述取代基模式。至此，化合物的結構得到確定，并命名為化合物命名為3-羥基-1-（1，7-二羥基-3，6-二甲氧基萘-2-基）-1-丙酮；英文名為3-hydroxy-1-（1，7-dihydroxy-3，6-dimethoxynaphthalen-2-yl）propan-1-one。

化合物1的紅外、紫外和質譜數據UV （甲醇），λmax （log ε） 332 （3.55），260 （3.18），215 （3.82） nm；IR （溴化鉀壓片）：νmax 3 425，3 064，2 959，2 771，1 682，1 618，1 542，1 441，1 350，1 167，1 288，1 154，1 046，1 012 cm-1；1H和13C-NMR數據 （CDCl3，500 和125 MHz）（表1）；正離子模式 ESI-MS m/z 315 [M+Na]+；正離子模式HR-ESI-MS m/z 315.085 2 [M+Na]+ （C15H16NaO6，計算值315.084 5）。

4 體外抗菌活性檢測

受試菌株為云南省第一人民醫院分離于臨床標本的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株。苯唑西林耐藥表型陽性（≥4 mg·L-1），且mecA基因檢測陽性。采用美國臨床與實驗室標準協會（CLSI，clinicaland laboratory standards institute）推薦的微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗，操作規范參照CLSIM07-A9標準，判定標準參照CLSIM100-S24標準，具體方法如下：① 抗菌藥物貯存液制備：制備抗菌藥物貯備液的質量濃度為2 560 mg·L-1，溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進行計算。配制好的抗菌藥物貯存液應貯存于-20 ℃以下環境，保存期不超過6個月。②待測菌的制備：用接種環挑取過夜培養的MH（A）培養皿上的單菌落于MH（B）培養基中，校準為0.5麥氏比濁標準，約含菌數1×108 CFU/mL，然后稀釋100倍，即得到約含菌數1×106 CFU/mL的菌液，備用。③分別將抗菌藥物貯備液母液（2 560 mg·L-1）稀釋10倍，得到濃度為256 mg·L-1的抗菌藥物溶液。取無菌的96孔板，第1孔加入200 μL的抗菌藥物，第2～10孔分別加入100 μL的MH肉湯培養基，從第1孔吸取100 μL加入第2孔，混勻，再吸取100 μL至第3孔，依次類推，第10孔吸取100 μL棄去。此時各孔藥物質量濃度依次為256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5 mg·L-1，第11孔加入200 μL菌液（陽性對照），第12孔加入200 μL MH（B）培養基（陰性對照）。④在1～10孔各加入50 μL之前備好的菌液，使每管最終菌液濃度約為5×105 CFU/mL，第1～11孔藥物濃度分別為128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25 mg·L-1。將接種好的96孔板放置37 ℃培養箱進行培養，24 h觀察菌液生長情況。同時用標準株做質控。⑤結果判斷與解釋：在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應檢查生長對照管的細菌生長情況是否良好，同時還應檢查接種物的傳代培養情況以確定其是否污染，質控菌株的MIC值是否處于質控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細菌生長者，即為受試菌的MIC。⑥測試結果表明，化合物1具有突出的抗菌活性，相比臨床在用的治療革蘭陽性菌引起感染的抗菌藥物而言具有明顯的抗菌優勢，MIC90為（48±4） mg·L-1，小于左氧氟沙星[左氧氟沙星>（58±5） mg·L-1]。

[參考文獻]

[1] 聶凌鴻. 蘆薈的開發利用[J]. 食品研究與開發，2006（2）：144.

[2] 何獻君，張雪丹，呂光璞，等. 蘆薈抑菌作用的研究進展[J]. 實驗技術與管理，2009（6）：215.

[3] 吳小芳，萬金志，鐘佳勝，等. 蘆薈化學成分的研究進展[J]. 熱帶作物學報，2015（8）：1542.

[4] Ibrahim S R M， Mohamed G A. Naturally occurring naphthalenes： chemistry， biosynthesis， structural elucidation， and biological activities [J]. Phytochem Rev， 2016， 15：279.

[5] Hu Q F， Zhou B， Gao X M， et al. Antiviral chromones from the stem of Cassia siamea [J]. J Nat Prod， 2012， 75：1909.

[責任編輯 丁廣治]