凱氏定氮法測定膠原蛋白海綿中蛋白質含量的不確定度評定

北京市醫療器械檢驗所（101111）吳曉麗 劉曦

測量不確定度的定義為表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相關聯的參數。在理化檢測中，對各類影響因素進行分析，評定其不確定度，不僅能幫助檢測人員確定檢測結果的可信程度，確保檢測結果的準確可靠，還能有助于識別出測定過程的關鍵環節，重點關注關鍵環節的質量控制，有效提高檢測工作的質量[1]。因此對測定方法進行不確定度評估是必要的。

膠原蛋白的特殊組織結構賦予其良好的止血及促進傷口愈合及組織修復功能，并具有高生物可降解性、高生物可吸收性、低抗原性等功能，這使其在醫藥衛生領域具有良好及廣泛的應用前景，廣泛應用于止血、創面愈合、骨缺損、神經修復等方面，被視為在科研和臨床應用中最有用途的生物材料之一[2][3]。

附表1 蛋白質含量重復性測定數據

本文以國家計量規范及相關文獻作為理論和方法指導[4-8]，對凱氏定氮法測定膠原蛋白海綿中蛋白質含量的不確定度進行了評估，最終得出檢測結果的擴展不確定度值。

1 原理

參考《中華人民共和國藥典》2015版四部通則蛋白質含量測定法第一法凱氏定氮法[9]中鎢酸沉淀法對膠原蛋白海綿中蛋白質含量進行測定。通過測定供試品的總氮含量以及經鎢酸沉淀去除蛋白質的供試品濾液中的非蛋白質氮含量，計算出蛋白質的含量。

2 儀器與試劑

硫酸標準滴定溶液（0.100mol/L）,容量瓶（100mL），滴定管（25mL、分度0.1mL），吸管（2mL、5mL、10mL和25mL），分析天平（0.01mg），定氮蒸餾裝置，硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、濃硫酸、硼酸、鎢酸鈉：均為分析純。試驗用水：Milli-Q純水機制備的超純水。

3 試驗過程

3.1 測定總氮含量樣品的消化 精密稱取樣品m1（精確至0.0001g），置凱氏定氮瓶中，加入0.3g硫酸銅、3g硫酸鉀和20mL硫酸消化至澄明，呈藍綠色，繼續消化1h，轉移至100mL容量瓶中，用超純水定容。

3.2 測定非蛋白氮含量樣品的消化 精密稱取樣品m2，加水14mL、10%鎢酸鈉溶液2mL、0.33mol/L硫酸溶液2mL，搖勻，靜置30分鐘過濾，取濾液5mL，置凱氏定氮瓶中，加入0.3g硫酸銅、3g硫酸鉀和20mL硫酸消化至澄明，呈藍綠色，繼續消化1h，轉移至100mL容量瓶中，用超純水定容。

3.3 測定 準確吸取10mL用于總氮含量測定的樣品試液加入定氮蒸餾裝置中進行蒸餾，接收液用0.005mol/L硫酸滴定液進行滴定至溶液顏色為灰紫，記錄所消耗的硫酸滴定液體積v1（mL）。將用于非蛋白氮含量測定的樣品試液移入定氮蒸餾裝置中，重復以上蒸餾、滴定步驟，記錄所消耗的硫酸滴定液體積v2（mL）。將空白對照溶液移入定氮管內，重復以上蒸餾、滴定步驟，用空白試驗進行校正，記錄所消耗的硫酸滴定液體積v0（mL）。

4 建立數學模型

式中：x—樣品中蛋白質含量，%；v1—樣品總氮含量測定溶液消耗的硫酸滴定液體積，mL；v2—樣品非蛋白氮含量測定溶液消耗的硫酸滴定液體積，mL；v0—空白對照溶液消耗的硫酸滴定液體積，mL；C—硫酸滴定液濃度（C(1/2H2SO4)），mol/L；n1—用于總氮含量測定的樣品稀釋倍數；n2—用于非蛋白氮含量測定的樣品稀釋倍數；m1—用于總氮含量測定的樣品質量，mg；m2—用于非蛋白氮含量測定的樣品質量，mg；14.01—氮的相對原子質量；F—5.55，換算系數（1g氮相當于5.55g蛋白質）。

5 不確定度的來源與量化

式中：urel(x)—膠原海綿中蛋白質含量的相對不確定度；urel(f)—樣品重復性測定產生的相對不確定度；urel(A)—測定樣品與空白時所用器具產生的相對不確定度；urel(c)—硫酸標準滴定溶液產生的相對不確定度；urel(m)—天平稱量產生的相對不確定度。

6 不確定度分量的評定

6.2.2 移液管引入的不確定度UrelV)測定樣品與空白時用到2mL移液管、5mL移液管、10mL移液管和25mL分度吸管，按均勻分布，各個移液管的相對標準不確定度見附表2。

附表2 移液管的不確定度

7 擴展不確定度分析

8 結論

由評定結果可以看出，膠原海綿中蛋白質含量測量結果的不確定度主要來自于樣品的稱量、移取、稀釋和重復性測定，其他部分的不確定度已隨機化，對測量結果的不確定度影響很小，均放在測量重復性不確定度中考慮。在實際工作中，應對影響測量結果的各種主要因素嚴格控制，以減少測量結果的不確定度，提高測量結果的可信度。樣品的稱量、移取、稀釋和重復性測定是凱氏定氮法測定膠原蛋白海綿中蛋白質含量不確定度的主要因素，在試驗中使用的玻璃儀器均為A級，不能通過提高器具的精密度改善結果，但可以通過下列措施對上述不確定度主要因素進行優化，可使測定結果更加可靠。①使用自動化凱氏定氮儀器對樣品進行消化和滴定，將有效控制試驗過程中產生的隨機誤差，降低由試驗重復性引起的不確定度。②在試驗方法允許的前提下，通過優化樣品的取樣量和滴定管的體積，降低天平稱量產生的相對不確定度Urel(m)和滴定管引入的相對不確定度Urel(B)，從而降低本方法的不確定度。