胰島素、雌激素和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)新生大鼠下頜骨成骨細(xì)胞增殖的影響*

鄂玲玲 徐文煥 喬朋艷 邢鶴琳 王 興 馮 琳 呂 燕 王東勝 劉洪臣

·論著·

胰島素、雌激素和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)新生大鼠下頜骨成骨細(xì)胞增殖的影響*

鄂玲玲 徐文煥 喬朋艷 邢鶴琳 王 興 馮 琳 呂 燕 王東勝 劉洪臣

目的：探討胰島素、雌激素和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的新生大鼠下頜骨成骨細(xì)胞(new born ratmandibular osteoblasts，NRMOBs)增殖的影響。方法：取新生6-7天SD乳鼠下頜骨，原代培養(yǎng)下頜骨成骨細(xì)胞，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代細(xì)胞，在糖生理濃度(5.5mM)下與6ug/m L胰島素(Insulin)和/或10-9mol/L雌激素(E2)共同孵育，于1，3，5，7，9d采用MTT(Methy lthiazol Tetrazolium，MTT)法檢測(cè)胰島素和雌激素對(duì)體外培養(yǎng)的NRMOBs增殖的影響。結(jié)果：所培養(yǎng)的NRMOBs陽(yáng)性表達(dá)波形絲蛋白、骨鈣素，角蛋白表達(dá)陰性，分泌堿性磷酸酶，形成鈣結(jié)節(jié)。NRMOBs在5.5mM葡萄糖下培養(yǎng)，1d時(shí)，雌激素顯著抑制細(xì)胞增殖；7d，9d時(shí)，胰島素顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，5.5mM+Insulin組細(xì)胞增殖顯著高于5.5mM+E2組；雌激素與胰島素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)影響。結(jié)論：在不同的培養(yǎng)時(shí)間，胰島素或雌激素單獨(dú)應(yīng)用均影響NRMOBs增殖，胰島素與雌激素聯(lián)合應(yīng)用能調(diào)節(jié)胰島素或雌激素單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對(duì)NRMOBs增殖的影響。

成骨細(xì)胞；胰島素；雌激素；下頜骨；大鼠

牙周病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥以及衰老等均可以造成牙槽骨吸收、牙周膜與牙槽骨的附著喪失、牙骨質(zhì)的厚度和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[1-6]，這常常會(huì)影響患者行種植牙手術(shù)以及術(shù)后骨結(jié)合率。因此，牙槽骨再生以及提高牙種植骨結(jié)合率是目前牙科醫(yī)生研究的熱點(diǎn)之一。胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。雌激素是由卵巢分泌的雌性脊椎動(dòng)物的性激素，具有促進(jìn)第二性征出現(xiàn)的作用。以胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足為特征的糖尿病伴隨著絕經(jīng)后雌激素分泌減少為特征的骨質(zhì)疏松癥，影響了骨代謝的最終效應(yīng)細(xì)胞之一的成骨細(xì)胞的增殖與分化。研究已證實(shí)胰島素除了調(diào)控糖、蛋白質(zhì)和脂肪的合成代謝外還同時(shí)具有生長(zhǎng)因子樣特性，是體內(nèi)重要的生長(zhǎng)因子之一，對(duì)成骨細(xì)胞的增值、分化有著重要影響[7]。雌激素屬類(lèi)固醇激素，研究表明雌激素通過(guò)直接調(diào)節(jié)機(jī)制、旁分泌機(jī)制和細(xì)胞凋亡機(jī)制對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)揮重要作用[8]，這些成骨細(xì)胞胚成起源多是中胚層，而頜骨成骨細(xì)胞胚成起源是來(lái)自于神經(jīng)嵴，胰島素以及雌激素又是怎樣影響頜骨成骨細(xì)胞的增殖呢？目前，胰島素和雌激素隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)頜骨成骨細(xì)胞增值的共同作用如何報(bào)道較少，為此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)這些體內(nèi)重要的激素在牙槽骨喪失及頜骨的骨質(zhì)疏松中的作用，分析胰島素及雌激素隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)新生大鼠下頜骨成骨細(xì)胞增殖的影響，為這些激素在臨床上如何更好的應(yīng)用在牙槽骨再生、牙種植術(shù)骨結(jié)合中提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 材料與儀器 L-DMEM(GIBCO公司，美國(guó))，胰蛋白酶(Am resco公司，美國(guó))，胎牛血清(Fetal bone serum,FBS,GIBCO公司，美國(guó))，噻唑藍(lán)(Methy lthiazol Tetrazolium MTT、牛血清白蛋白，Sigma公司，美國(guó))，小鼠抗人波形絲蛋白、角蛋白抗體、大鼠抗兔骨鈣素抗體(中杉金橋公司，北京)， 4′,6-diam idino-2-pheny lindole(DAPI,Biotium，美國(guó))，羅丹明(TRITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG，(Jackson，美國(guó))，正常山羊血清(中杉金橋公司，北京)，其他相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

水浴振蕩器(HZS-HA，哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠)，溫控超速離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó))，超凈工作臺(tái)(長(zhǎng)城空氣凈化，北京)，ELx800uv酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Tek，美國(guó))，3111型CO2恒溫孵箱(ThermoForma，美國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，美國(guó))，DM IL倒置相差顯微鏡及MPS30曝光系統(tǒng)(Leica，德國(guó))，F(xiàn)V 500全反射激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 NRMOBs的原代培養(yǎng) 用酶消組織塊培養(yǎng)法[9]培養(yǎng)新生大鼠下頜骨成骨細(xì)胞。將SD新生6-7d的乳鼠(解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)，SPF級(jí))置于75%酒精中浸泡5m in，取出下頜骨，剝離肌肉和筋膜，將下頜骨剪成1mm×1mm×1mm的骨片，加0.125%胰酶，在水浴振蕩器中37℃、140rpm消化8m in，消化6次后終止，離心收集經(jīng)酶消化后的組織塊，再次剪碎，鋪于培養(yǎng)瓶中加含20%胎牛血清L-DMEM在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下放置于恒溫孵箱倒置培養(yǎng)，4小時(shí)后翻瓶。待細(xì)胞爬出長(zhǎng)至匯合單層時(shí)傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，取第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 NRMOBs的鑒定 將第4代新生大鼠下頜骨成骨細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/m L接種在蓋玻片上，細(xì)胞培養(yǎng)3d時(shí)棄去培養(yǎng)液，95%酒精固定15m in后，用免疫熒光染色[10]檢測(cè)波形絲蛋白、角蛋白、骨鈣素。方法簡(jiǎn)述如下：取出細(xì)胞爬片，PBS漂洗3×5m in。室溫下用0.5%TritonX-100作用10m in，PBS漂洗3×5m in。封閉血清室溫孵育20m in后，加一抗波形絲蛋白、角蛋白、骨鈣素(1∶100)，PBS代替一抗為空白對(duì)照，4℃下過(guò)夜，PBS漂洗3×5m in，然后用TRITC標(biāo)記的二抗(1∶50)室溫下作用45m in，PBS漂洗3×5m in，DAPI染核15m in，PBS漂洗3×5m in。用90%的甘油PBS溶液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相。

將第4代NRMOBs以1×105個(gè)細(xì)胞/m L接種在蓋玻片上，細(xì)胞培養(yǎng)7d時(shí)棄去培養(yǎng)液，95%酒精固定15m in后，用Gomori鈣-鈷法[9]進(jìn)行堿性磷酸酶染色。

將第4代NRMOBs以1×105個(gè)細(xì)胞/m L接種在蓋玻片上，細(xì)胞培養(yǎng)28d后用95%乙醇固定15m in后，蒸餾水漂洗，加入2%茜素紅溶液(用2%酒精配制，PH 8.3)染色5m in，自來(lái)水沖洗5次后，封片，顯微鏡下觀察、照相。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 為了探討胰島素及雌激素對(duì)體外培養(yǎng)NRMOBs增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)共分為4組：5.5mM葡萄糖、5.5mM葡萄糖+6ug/m L胰島素、5.5mM葡萄糖+10-9mol/L雌激素、5.5mM葡萄糖+6ug/m L胰島素+10-9mol/L雌激素。

1.5 胰島素和雌激素對(duì)體外培養(yǎng)的NRMOBs增殖實(shí)驗(yàn) 取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化、離心、重懸后，接種細(xì)胞于96孔板中，接種密度為5×104/m L，每孔接種0.2m L。細(xì)胞貼壁24h后，換用含0.2%牛血清白蛋白無(wú)血清L-DMEM培養(yǎng)液饑餓24h，然后按實(shí)驗(yàn)分組加含5%胎牛血清、5.5mM葡萄糖、和/或6ug/m L胰島素及10-9mol/L雌激素的L-DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，每3d換一次液，第1、3、5、7、9d采用MTT比色法于490nm處測(cè)定細(xì)胞吸光值，每組設(shè)8個(gè)樣本。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果以均值表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件的三因素方差分析以及單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)方差齊時(shí)采用Bonefrroni法，當(dāng)方差不齊時(shí)采用Talnhane法，P＜0.05為差異具有顯著性。

2.結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)24h后，經(jīng)酶消化后的下頜骨組織塊已貼壁。3d后，細(xì)胞從貼壁的下頜骨碎片爬出，呈三角形或梭形(圖1A)。數(shù)天后爬出的細(xì)胞明顯增加，以骨塊為中心，向周?chē)树[片樣生長(zhǎng)，瓶底長(zhǎng)滿(mǎn)至90%即可傳代。傳代后的細(xì)胞核明顯增大，形態(tài)多樣化，胞漿豐富，向外伸展出生長(zhǎng)突，生長(zhǎng)突逐漸增多，細(xì)胞借突起相互連接，呈重疊生長(zhǎng)(圖1B)。

2.2 NRMOBs的鑒定 第4代的NRMOBs免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的細(xì)胞胞漿角蛋白表達(dá)陰性(圖2A)，波形絲蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，染成綠色(圖2B)，骨鈣素表達(dá)陽(yáng)性(圖2C)，DAPI染核成藍(lán)色。ALP染色結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有黑色顆粒狀物質(zhì)，有少量分散在細(xì)胞周?chē)?圖1C)。第4代成骨細(xì)胞傳代后，細(xì)胞匯合時(shí)均呈多層重疊生長(zhǎng)，細(xì)胞呈矮柱形或方形，可在局部聚集成灶，形成鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)被染成橘紅色顆粒或塊狀沉淀(圖 1D)。

圖1 NRMOBs的培養(yǎng)及鑒定A.原代培養(yǎng)5d的NRMOBs(×100)B.P4 的 NRMOBs(×100)C.P4代NRMOBs組織學(xué)染色ALP陽(yáng)性 (×100)D.P4代NRMOBs鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色 (×100)

圖2 NRMOBs的鑒定A.P4代NRMOBs免疫熒光染色角蛋白表達(dá)陰性，DAPI染核成藍(lán)色 (×200)B.P4代NRMOBs免疫熒光染色波形絲蛋白表達(dá)陽(yáng)性，染成紅色，DAPI染核成藍(lán)色 (×200)C.P4代NRMOBs免疫熒光染色骨鈣素表達(dá)陽(yáng)性，染成紅色，DAPI染核成藍(lán)色 (×200)

2.3 胰島素、雌激素及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)5.5mM葡萄糖培養(yǎng)下的NRMOBs增殖的影響 第四代NRMOBs在含5.5mM、5.5mM+insulin、5.5mM+E2、5.5mM+insulin+E2的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于1、3、5、7、9d時(shí)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)進(jìn)行三因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因素胰島素，P=0.003；因素雌激素，P=0.007；因素時(shí)間，P=0；因素胰島素*雌激素的交互作用，P=0.845；因素胰島素*時(shí)間的交互作用，P=0.394；因素雌激素*時(shí)間的交互作用，P=0.453；因素胰島素*雌激素*時(shí)間的交互作用，P=0.299。四組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞不斷增殖，1d時(shí)，胰島素、雌激素、胰島素與雌激素聯(lián)合應(yīng)用均抑制了細(xì)胞的增殖，但僅僅雌激素的抑制作用具有顯著的意義(P＜0.05)；3、5d時(shí)，胰島素、雌激素、胰島素與雌激素聯(lián)合應(yīng)用開(kāi)始促進(jìn)細(xì)胞的增殖，與5.5mM組沒(méi)有了明顯的差異；到了7、9d時(shí)，與5.5mM組比，胰島素已顯著促進(jìn)了細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，同時(shí)，5.5mM+insulin組的細(xì)胞增殖也顯著高于5.5mM+E2組(P＜0.05)。胰島素和雌激素聯(lián)合在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中對(duì)細(xì)胞的增殖作用與5.5mM組沒(méi)有差別(圖3)。

圖3 胰島素及雌激素對(duì)5.5mM葡萄糖培養(yǎng)下的NRMOBs增殖的影響(x± s，n=8)。P＜0.05，*分別與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)5.5mM葡萄糖組比較；分別與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)5.5mM+insulin組比較。

3.討論

牙槽骨再生常常受到牙周病、系統(tǒng)性疾病以及衰老等的影響，從而影響牙種植體早期骨結(jié)合率。胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素，除了調(diào)控糖、蛋白質(zhì)和脂肪的合成代謝外還同時(shí)具有生長(zhǎng)因子樣特性，是體內(nèi)重要的生長(zhǎng)因子之一，對(duì)成骨細(xì)胞的增值、分化有著重要影響[7]。雌激素是由卵巢分泌的雌性脊椎動(dòng)物的性激素，具有促進(jìn)第二性征出現(xiàn)的作用，屬類(lèi)固醇激素，研究表明雌激素通過(guò)直接調(diào)節(jié)機(jī)制、旁分泌機(jī)制和細(xì)胞凋亡機(jī)制對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)揮重要作用[8]。下頜骨成骨細(xì)胞是來(lái)源于頜骨的一種成骨細(xì)胞，在牙槽骨再生和重建中起著重要作用，下頜骨成骨細(xì)胞表面存在著胰島素受體和雌激素受體[11,12]，胰島素和雌激素是如何影響其增值，倆者對(duì)其增值的共同作用如何？其確切的機(jī)制不清楚，并且缺乏來(lái)自細(xì)胞學(xué)的直接證據(jù)。

基于此，本實(shí)驗(yàn)將新生大鼠下頜骨成骨細(xì)胞置于生理糖濃度5.5mM下培養(yǎng)，加入胰島素和/或雌激素，觀察體外培養(yǎng)的大鼠下頜骨成骨細(xì)胞的增殖情況。在5.5mM糖濃度培養(yǎng)下，細(xì)胞增殖的數(shù)據(jù)進(jìn)行三因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因素胰島素P=0.003；因素雌激素P=0.007；因素時(shí)間P=0；因素胰島素*雌激素的交互作用P=0.845；因素胰島素*時(shí)間的交互作用P=0.394；因素雌激素*時(shí)間的交互作用P=0.453；因素胰島素*雌激素*時(shí)間的交互作用P=0.299。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果可見(jiàn)，NRMOBs在生理糖濃度5.5mM培養(yǎng)下，胰島素或雌激素或培養(yǎng)時(shí)間單獨(dú)對(duì)NRMOBs的增殖均有顯著效應(yīng)，但胰島素*雌激素、胰島素*時(shí)間、雌激素*時(shí)間、胰島素*雌激素*時(shí)間對(duì)NRMOBs的增殖均沒(méi)有交互效應(yīng)；雌激素在1d時(shí)顯著抑制了NRMOBs的增殖(P＜0.05)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)3-9d時(shí)，雌激素對(duì)NRMOBs增殖的抑制作用降低，與對(duì)照組沒(méi)有了差別；在1-5d時(shí)，胰島素對(duì)NRMOBs的增殖沒(méi)有影響，到7、9d時(shí)開(kāi)始顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但胰島素和雌激素聯(lián)合應(yīng)用在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中對(duì)細(xì)胞的增殖均沒(méi)有影響。1d時(shí)，雌激素在生理糖濃度下抑制細(xì)胞的增殖，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，雌激素對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響，這或許是正常細(xì)胞早期時(shí)對(duì)雌激素的一個(gè)急性應(yīng)激反應(yīng)。胰島素早期時(shí)對(duì)生理糖濃度下NRMOBs的增殖無(wú)影響，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)開(kāi)始顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這種促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力顯著高于雌激素，可見(jiàn)，在生理糖濃度下，胰島素和雌激素對(duì)NRMOBs增殖的影響各不相同，胰島素隨著應(yīng)用時(shí)間的延長(zhǎng)促進(jìn)細(xì)胞增殖，雌激素短期時(shí)抑制細(xì)胞增殖，且兩者沒(méi)有交互效應(yīng)。

本研究結(jié)果證實(shí)在生理濃度的葡萄糖下胰島素促進(jìn)下頜骨成骨細(xì)胞增值，雌激素抑制下頜骨成骨細(xì)胞的增值，為倆者在臨床上更好的應(yīng)用于牙槽骨再生以及提高牙種植體骨結(jié)合率提供了一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在高糖情況下胰島素以及雌激素隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)又是如何影響下頜骨成骨細(xì)胞的增值，倆者共同作用又如何，課題組將進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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Effectsof insulin,estrogen and culture time on the proliferation of newborn ratmandibular osteoblasts

E Ling-ling,XUWen-huan,QIAO Peng-yan,XING He-lin,WANG Xing,FENG Lin,LV Yan,WANG Dong-sheng,LIU Hong-chen
(Stomatologic institute,Chinese PLAGeneralHospital,Beijing 100853,China)

Objective:To investigate theeffectof insulin(In),estrogen(E2)and culture timeon the proliferation ofnewborn ratmandibular osteoblasts(NRMOBs).M ethods:The NRMOBs were cultured in vitro.The effect of insulin(6ug/m L)and/or estrogen(10-9mol/L)and/or culture time on NRMOBswas investigated.The NRMOBs proliferation was examined after1、3、5、7、9 daysof culture using Methylthiazol Tetrazolium(MTT).Results:The NRMOBs positively expressed vimentin and osteocalcin,negatively expressed keratin,secreted alkaline phosphatase(ALP),and produced calcium nodules.When NRMOBswere cultured in themediaw ith 5.5mM glucose,estrogen significantly decreased the cells proliferation at 1 day of culture,insulin significantly increased the cells proliferation at 7,9 day of culture.Compared to 5.5mM+E2,5.5mM+Insulin significantly increased NRMOBs proliferation at 7,9 day of culture.The combination of insulin and estrogen had no effecton the proliferation of NRMOBsatevery time point.Conclusion:This study suggests that insulin or estrogen alone affects NRMOBs proliferation in different culture time.The combination of insulin and estrogen can adjust the effectof insulin orestrogen alone on NRMOBs proliferation.

osteoblasts;insulin;estrogen;mandibular;rat

R783

A

1672-2973(2017)05-0257-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：81271180)解放軍總醫(yī)院臨床科研扶持基金(項(xiàng)目編號(hào)：2016FC-CXYY-2007；2015FC-CXYY-1003)

鄂玲玲 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所 副研究員 北京 100853

徐文煥 共同第一作者 解放軍總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部訓(xùn)練(研究生)處 助理員 北京 100853

喬朋艷 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所 博士后 北京 100853

邢鶴琳 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所 博士后 北京 100853

王 興 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所 博士后 北京 100853

馮 琳 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所 博士后 北京 100853

呂 燕 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所 實(shí)驗(yàn)員 北京 100853

王東勝 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所 副主任技師 北京 100853

劉洪臣 通訊作者 解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所 所長(zhǎng) 主任醫(yī)師 教授 北京 100853

2017-06-10)