反相高效液相色譜法測(cè)定利卡西平血藥濃度

張國陽，何銀舟，王 利（.淮安市第三人民醫(yī)院，江蘇 淮安 300；.淮安市楚州醫(yī)院，江蘇 淮安 399）

反相高效液相色譜法測(cè)定利卡西平血藥濃度

張國陽1，何銀舟2，王 利1（1.淮安市第三人民醫(yī)院，江蘇 淮安 223001；2.淮安市楚州醫(yī)院，江蘇 淮安 223299）

目的：建立利卡西平血藥濃度測(cè)定方法。方法：采用反相高效液相色譜法，色譜柱：Waters sunf i re C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-三氟乙酸（600 : 400 : 0.5）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：20 μL。內(nèi)標(biāo)物：鹽酸賽庚啶。結(jié)果：以利卡西平與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比（y）對(duì)利卡西平血清濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：C = 1.227×102y – 0.364（r2= 0.9996，n = 7），結(jié)果表明利卡西平在5.0 ～ 100.0 μg·mL-1范圍內(nèi)樣品回收率高（平均回收率為99.80%，RSD = 1.25%）。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便、精密度好，可用于利卡西平的治療藥物監(jiān)測(cè)。

利卡西平；反相高效液相色譜法；血藥濃度；治療藥物監(jiān)測(cè)

[KEY WORDS]Licarbazepine; RP-HPLC; Blood drug concentration; Therapeutic drug monitoring

卡馬西平在治療過程中易產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，其初級(jí)代謝產(chǎn)物奧卡西平能降低副作用，但療效亦明顯降低。奧卡西平的再代謝產(chǎn)物利卡西平亦具有抗癲癇作用。利卡西平由葡萄牙Bial制藥公司開發(fā)，于2009年上市，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)該藥用于癲癇部分發(fā)作的附加治療。由于奧卡西平本身具有抗癲癇作用，口服后吸收迅速，代謝速度極快，在肝臟轉(zhuǎn)化為真正起作用的利卡西平[1-2]，因此臨床上對(duì)奧卡西平的量-效評(píng)價(jià)是通過對(duì)其活性代謝物利卡西平來實(shí)現(xiàn)，主要測(cè)定利卡西平而非奧卡西平。利卡西平血藥濃度的測(cè)定方法國內(nèi)外已有報(bào)道[3-7]，本文采用反相高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便、速度快且重現(xiàn)性好，可用于利卡西平的治療藥物監(jiān)測(cè)。

1 儀器與試藥

1525-2489型高效液相色譜儀，包括Breeze型二維色譜軟件，配7725i六通閥，20 μL定量環(huán)（美國Waters公司）；利卡西平（大連美侖生物技術(shù)有限公司分裝美國Tocris Bioscience公司，純度≥98%，批號(hào)：2A/153031）；鹽酸賽庚啶（常州四藥制藥有限公司，純度99.6%，批號(hào)：140225）。甲醇、乙醚、三氟乙酸均為色譜純（均由江蘇漢邦科技有限公司提供），氫氧化鈉（上海試劑一廠，分析純）、硼砂（宜興試劑廠，分析純）。奧卡西平片（曲萊，Novartis Farma S.p.A，規(guī)格：0.3 g，批號(hào)：T1880）；水為自制高純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters sunf i re C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-三氟乙酸（600 : 400 : 0.5）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 對(duì)照液及內(nèi)標(biāo)液的制備

精密稱取利卡西平標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，溶解于甲醇并定容至100 mL，得利卡西平標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1 mL，加甲醇至100 mL，得10 μg·L-1利卡西平標(biāo)準(zhǔn)液。

精密稱取鹽酸賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，溶解于甲醇并定容至100 mL，得鹽酸賽庚啶內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液10 mL，加甲醇至100 mL，得100 μg·L-1鹽酸賽庚啶內(nèi)標(biāo)液。

2.3 樣品處理

取具塞離心管分別加入鹽酸賽庚啶內(nèi)標(biāo)液10 μL，氮?dú)饬鲹]干。精密吸取血清樣品1 mL，渦旋混合1 min，加入2 moL·L-1氫氧化鈉-硼砂飽和溶液250 μL，渦旋混勻1 min，加乙醚3 mL，渦旋混合10 min后3000 r·min-1低溫離心3 min，取上層液（油相）2.0 mL。下層液（水相）再加乙醚3 mL，渦旋混合10 min后3000 r·min-1低溫離心3 min，取上層液（油相）3.0 mL。合并上層液（油相），于40 ℃水浴氮?dú)饬鲹]干，100 μL流動(dòng)相復(fù)溶（渦旋混合1 min）。進(jìn)樣20 μL。色譜分析。

3 結(jié)果

3.1 專屬性和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取空白血清、空白血清 + 利卡西平 +內(nèi)標(biāo)、患者血清 +內(nèi)標(biāo)。按“2.3”項(xiàng)下操作，其色譜圖見圖1。利卡西平、鹽酸賽庚啶的保留時(shí)間分別為4.28 min、5.72 min，利卡西平與鹽酸賽庚啶分離度為3.31。理論塔板數(shù)按利卡西平、鹽酸賽庚啶計(jì)算分別為2980、3250。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢測(cè)限

取具塞離心管分別加入利卡西平標(biāo)準(zhǔn)溶液，鹽酸賽庚啶內(nèi)標(biāo)液10 μL，用氮?dú)饬鞔蹈珊?，加? mL空白血清，使鹽酸賽庚啶濃度為1 μg·mL-1，利卡西平濃度分別為5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、80.0、100.0 μg·mL-1，按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行分析，建立利卡西平的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以利卡西平與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（y）對(duì)利卡西平血清濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程C=1.227×102y– 0.364（r2= 0.9996，n= 7），結(jié)果表明利卡西平在5.0 ～ 100.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。采用逐步稀釋法，當(dāng)信噪比（S/N）為3時(shí)，最低檢測(cè)濃度為5.0 μg·mL-1。

3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

將已知濃度（30 μg·mL-1）的利卡西平血清樣品分別置于室溫避光保存8 h、4 ℃冷藏24 h、反復(fù)凍融3次、– 20 ℃凍存1周，分別測(cè)定其含量。結(jié)果表明：利卡西平血清樣品穩(wěn)定性良好（峰面積RSD值在±7%之內(nèi)）。

3.4 方法精密度與相對(duì)回收率

取用空白血清配制的含5.0、30.0、100.0 μg·mL-1三種濃度的樣品， 依“2.3”項(xiàng)下操作，以利卡西平與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比在曲線上求出利卡西平的濃度，其結(jié)果見表1。

在第1天內(nèi)測(cè)定3份樣品，每種濃度測(cè)定5份，統(tǒng)計(jì)測(cè)定數(shù)據(jù)的RSD即為日內(nèi)精密度。在2周內(nèi)任選取5 d，每天測(cè)定以上3種濃度樣品各5份，統(tǒng)計(jì)5 d間（包括第1天）測(cè)定數(shù)據(jù)的RSD，即為日間精密度，并以實(shí)測(cè)濃度與實(shí)際濃度之比計(jì)算回收率。詳見表2。

表1 日間、日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 5Tab 1 Precision results of intra-day and inter-day. n = 5

表2 樣品回收率. n = 5Tab 2 Recovery rate of samples. n = 5

3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取10 μg·mL-1利卡西平標(biāo)準(zhǔn)液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，結(jié)果顯示RSD值為0.95%，表明進(jìn)樣精密度較好。

3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取空白血清配制的含30.0 μg·mL-1樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定利卡西平的濃度，重復(fù)6次，含量的RSD值為2.06%，表明本法的重復(fù)性良好。

3.7 干擾性實(shí)驗(yàn)

針對(duì)臨床治療用藥，測(cè)試了神經(jīng)科可能存在的聯(lián)合用藥情況。具體品種有苯巴比妥（tR= 3.75 min）、苯妥英鈉（tR= 5.21 min）、拉莫三嗪（tR= 3.77 min）、卡馬西平（tR= 6.11 min）；鎮(zhèn)靜催眠藥：氯硝西泮（tR=6.22 min）、阿普唑侖（tR= 8.45 min）、艾司唑侖（tR=7.31 min）、咪達(dá)唑侖（tR= 13.37 min）、扎米普?。╰R=4.85 min）。與利卡西平及內(nèi)標(biāo)物均分離良好。

3.8 患者血漿中利卡西平的測(cè)定

患者Ⅰ，男性，26歲，體質(zhì)量52 kg，2017年5月入院，診斷為部分型癲癇，服用奧卡西平0.3 g，bid，6 d后癥狀控制，第7天晨起服藥前抽取肘靜脈血3 mL。

患者Ⅱ，男性，51歲，體質(zhì)量73 kg，2017年4月入院，診斷為部分型癲癇，服用奧卡西平0.45 g，bid，7 d后癥狀控制，第8天晨起服藥前抽取肘靜脈血3 mL。

取上述患者血清各1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定患者血清中利卡西平濃度，每個(gè)血樣測(cè)定一次，其結(jié)果分別為18.65 μg·mL-1和24.60 μg·mL-1。

4 討論

4.1 臨床意義

口服奧卡西平在肝細(xì)胞內(nèi)芳基酮還原酶的作用下迅速轉(zhuǎn)化為利卡西平。不同年齡段的癲癇患兒利卡西平穩(wěn)態(tài)血藥濃度差別大，同劑量奧卡西平，利卡西平的AUC值（劑量校正）在2 ～ 5歲的兒童中比在6 ～12歲的兒童中低約30.0%[7]。利卡西平血藥濃度監(jiān)測(cè)對(duì)于不良反應(yīng)，尤其是對(duì)老人、兒童、孕婦、腎功能損害者等特殊患者更有意義[8-9]。當(dāng)利卡西平的濃度超過35 μg·mL-1時(shí)，較易發(fā)生疲勞、頭痛、頭暈、嗜睡和低鈉血癥等不良反應(yīng)。因此，監(jiān)測(cè)利卡西平濃度有必要且比監(jiān)測(cè)奧卡西平更具臨床意義。

4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

利卡西平結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)苯環(huán)具有明顯的紫外吸收。紫外掃描發(fā)現(xiàn)，在210 nm、254 nm及270 nm處有吸收峰，在210 nm波長(zhǎng)處吸收度最大。但考慮210 nm與甲醇的最大截止波長(zhǎng)205 nm比較接近，造成基線的擾動(dòng)較大。在兼顧利卡西平和內(nèi)標(biāo)物的情況下，于230 nm處背景吸收度較小，測(cè)定物質(zhì)吸收度相對(duì)均較大，色譜峰尖銳穩(wěn)定，可用于定量。

4.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

使用鹽酸賽庚啶為內(nèi)標(biāo)，價(jià)廉易得，與常用抗癲癇藥聯(lián)用機(jī)會(huì)少。其內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間長(zhǎng)于利卡西平，與其得到了良好的分離，與神經(jīng)科常用藥物（抗癲癇藥、鎮(zhèn)靜催眠藥）得到了良好的分離，提高了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度，便于推廣應(yīng)用。

4.4 萃取劑

國外文獻(xiàn)報(bào)道血漿藥物提取采用固相萃取或用混合提取劑[10-11]，操作繁瑣且費(fèi)用昂貴。本文分別采用乙醚、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿為提取劑，比較發(fā)現(xiàn)：乙醚沸點(diǎn)低，樣品處理時(shí)間短，單次提取率較高（約80%）但欠穩(wěn)定，二次提取，其提取率高且穩(wěn)定；正己烷提取率最低，其余均不理想。同時(shí)考察了加入氧氧化鈉溶液堿化血樣對(duì)萃取率的影響。實(shí)驗(yàn)表明，堿化血樣對(duì)利卡西平萃取回收率無顯著影響，但對(duì)內(nèi)標(biāo)物鹽酸賽庚啶有影響，堿化血樣可使其萃取率高且穩(wěn)定。故采用堿化血樣乙醚二次萃取，取得了滿意的結(jié)果。

4.5 流動(dòng)相對(duì)利卡西平峰形、峰位的影響

甲醇與水的比例對(duì)峰位有影響，pH ＜ 5.8時(shí)，峰形尖銳且穩(wěn)定。本文采用三氟乙酸定量配比，可提供酸性流動(dòng)相且配制方法簡(jiǎn)單迅速。

4.6 有效血藥濃度監(jiān)測(cè)與臨床療效

目前尚無國際公認(rèn)的奧卡西平治療濃度參考值范圍，國外有多個(gè)版本，如3 ～ 40[9]、12 ～ 30[12]、3 ～35 μg·mL-1[13]等。國內(nèi)缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)，有學(xué)者認(rèn)為：對(duì)于大多數(shù)癲癇患者，控制利卡西平谷濃度大于8.5 μg·mL-1時(shí)對(duì)癲癇發(fā)作控制較好[6]。針對(duì)國人的利卡西平有效血藥濃度范圍仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，采用反相高效液相色譜法測(cè)定利卡西平的血藥濃度，峰形穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，萃取率高，內(nèi)標(biāo)物價(jià)廉易得，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以作為一種檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床。

[1] Franceschi L, Furlanut M. A simple method to monitor plasma concentrations of oxcarbamazepine, carbamazepine, their main metabolites and lamotrigine in epileptic patients[J]. Pharmacol Res, 2005, 51(4): 297-302.

[2] 謝建偉，蘇為科，周兆良.奧卡西平合成路線圖解[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36（2）：123-125.

[3] Volosob A, Bialer M, Xiaodong S, et al. Simultameous streoselective high-performance liquid chromatographic determination of 10-hydroxycarbazepine and its metabolite carbamazipine-10, 11-trans dihydrodiol in human urine[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 2000, 738(2): 419-425.

[4] Levert H, Odou P, Robert H. LC determination of oxcarbamazepine and its active metabolite in human serum[J]. J Pharm Biomed And, 2002, 28(3-4): 517-525.

[5] 付琳，邱相君，代宗順，等.奧卡西平的人體相對(duì)生物利用度研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（3）：244-277.

[6] 張全英，徐文俊，俞蘊(yùn)莉.高效液相色譜法測(cè)定癲癇患者血漿中奧卡西平活性代謝物的濃度及其血藥濃度與療效關(guān)系評(píng)價(jià)[J].中國生化藥物雜志，2015，35（1）：106-109.

[7] 林志燕，劉海濤，舒揚(yáng)，等.217例次癲癇患兒血清奧卡西平代謝物濃度監(jiān)測(cè)分析[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32（1）：12-14.

[8] Bring P, Ensom MH. Does oxcarbamazepine warrant therapeutic drug monitoring: a critical review[J]. Clin Pharmacokinet, 2008,47(12): 767-778.

[9] Bouquie R, Dailly E, bentue-Ferrer D. Therapeutic drug monitoring of oxcarbamazepine [J]. Therapie, 2010, 65(1): 61-65.[10] Bugamelli F, Sabbioni C, Mandrioli R, et al. Simultaneous analysis of six antiepileptic drugs and two selected metabolites in human plasma by liquid chromatography after solidphase extraction[J]. Anal Chin Acta, 2002, 472(1): 1-10.

[11] Qi ML, Wang P, Wang LJ, et al. LC method for the determination of oxcarbazepine in pharmaceutical preparations[J]. J Pharm Biomed Anal, 2003, 31(1): 57-62.

[12] Sims PJ. Applied pharmacokinetics pharmacodynamics principles of therapeutic drug monitoring[J]. Am J Phar Educ, 2006, 70(6): 148.

[13] Krasowski MD. Therapeutic drug monitoring of the newer antiepilepsy medications[J]. Pharmaceuticals, 2010, 3(6): 1909-1935.

The determination of licarbazepine concentration in patients' plasma by RP-HPLC

ZHANG Guo-yang1, HE Yin-zhou2, WANG Li1(1. Huai'an No.3 People's Hospital, Huai'an 223001, China; 2.Huai'an Chuzhou Hospital,Huai'an 223299, China)

Objective:To set up the HPLC method for determination of licarbazepine concentration in patient's plasma.Methods:The residues were analyzed by RP-HPLC method. Waters sunfire C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was used,methanol-water-trifluoroacetic acid (600 : 400 : 0.5) was used as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was set at 230 nm and the column temperature was 40 ℃ . The sample size was 20 μL. Cyproheptadine hydrochloride was used as internal standard.Results:Linear regression analysis was made by licarbazepine serum concentration (C) and the peak area ratio (y)of licarbazepine vs internal standard. The regression equation was C = 1.227 × 102y – 0.364 (r2= 0.9996, n = 7). The results showed that the recovery ratio of licarbazepine was high in the range of 5.0 – 100.0 μg·mL-1(average recovery rate = 99.80%, RSD = 1.25%).Conclusion:The method provided a simple and precise way for monitoring plasma concentration level of licarbazepine, and this method can be used for therapeutic drug monitoring of licarbazepine.

R917

A

1672 – 8157(2017)05 – 0267 – 04

何銀舟，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作。

E-mail：czyyybk@163.com

張國陽，男，主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作。

E-mail：pharm_zhang@163.com

2017-02-10

2017-05-22）