通腦液的質量標準研究

王秀琴 ，錢秋玉，王東興，石 蕾，陳 軍（陸軍總醫院263臨床部藥劑科，北京 101149）

通腦液的質量標準研究

王秀琴 ，錢秋玉，王東興，石 蕾，陳 軍（陸軍總醫院263臨床部藥劑科，北京 101149）

目的：建立通腦液的質量標準。方法：采用薄層色譜法（TLC）對處方中西紅花進行定性鑒別；采用HPLC法測定西紅花中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量，色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），甲醇-水（48∶52）為流動相，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長440 nm，進樣量10 μL。結果：薄層鑒別專屬性強，分離效果好。西紅花苷Ⅰ在9.66 ～ 57.94 μg·mL-1呈良好的線性關系（r = 1），西紅花苷Ⅱ在5.91 ～ 35.48 μg·mL-1呈良好的線性關系（r = 0.9999），平均回收率分別為98.4%（RSD = 1.21%，n = 9），99.4%（RSD = 1.70%，n = 9）。結論：該方法簡便、準確、重復性好，可作為通腦液的質量控制方法。

西紅花；西紅花苷Ⅰ；西紅花苷Ⅱ；高效液相色譜法

[KEY WORDS]Saffron; Crocin Ⅰ; Crocin Ⅱ; HPLC

通腦液由西紅花、石菖蒲、川芎、水蛭等九味藥材研制而成，主要用于治療腦梗死、腦缺血、腦卒中恢復期、腦外傷及腦炎后遺癥、腦癱等癥狀。原標準中鑒別川芎[1]、西紅花不足以控制通腦液的質量，增加該制劑中石菖蒲、水蛭的薄層鑒別，以更好的控制本品質量，該實驗另文有報道。國內外大量研究表明，西紅花提取物在抗心血管系統疾病、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、防治糖尿病并發癥等方面有明確的生物活性[2-3]。本實驗采用薄層色譜法（TLC）對處方中君藥西紅花進行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測定西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量，作為通腦液的質量控制指標。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BT125D型電子天平（德國賽多利斯公司）；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；LDZ5-2型離心機（北京京立離心機有限公司）；ZF-2型紫外燈（上海嘉鵬科技有限公司）；851-2型遠紅外快速干燥箱（上海向陽無線電元件廠）。甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；純化水（自制）；西紅花苷Ⅰ對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：91.1%，批號：111588-201202，本品需冷凍遮光保存，使用前無需處理）；西紅花苷Ⅱ對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：92.4%，批號：111589-201304，本品需冷凍遮光保存，使用前無需處理）。 通腦液（解放軍第二五五醫院配制，每支8 mL，批號：20141117、20150309、20150415）。

2 方法與結果

2.1 西紅花TLC鑒別

取西紅花對照藥材0.02 g，加甲醇4 mL，密塞，振搖，靜置30 min，取上清液作為藥材對照溶液。再另取缺西紅花的通腦液陰性樣品10 mL，濃縮至約2 mL，作為陰性對照溶液。吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄板上，以醋酸乙酯-甲酸-水（5 : 1 : 0.6）的上層溶液為展開劑，展開檢視。實驗表明，供試品溶液在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同黃色的熒光斑點，陰性樣品未見干擾。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（48 : 52）；檢測波長：440 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；理論塔板數按照西紅花苷Ⅰ峰計算應不低于3500。

2.3 溶液的制備

（1）西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ對照品溶液的制備：取西紅花苷Ⅰ對照品10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得西紅花苷Ⅰ對照品儲備液。精密量取1 mL西紅花苷Ⅰ對照品儲備液置10 mL量瓶中加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得西紅花苷Ⅰ對照品溶液（10 ℃以下保存）。再另取西紅花苷Ⅱ對照品12 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得西紅花苷Ⅱ對照品儲備液。精密量取1 mL西紅花苷Ⅱ對照品儲備液置10 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得西紅花苷Ⅱ對照品溶液（10 ℃以下保存）。精密量取西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ對照品儲備液各1 mL于10 mL量瓶中稀釋至刻度，搖勻，即得（10 ℃以下保存）。（2）供試品溶液的制備：精密量取本品1 mL于10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，即得。（3）陰性樣品溶液的制備：精密吸取缺西紅花的通腦液陰性樣品1 mL置10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 系統適用性實驗

分別精密吸取“2.3”項下對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各5 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣。結果顯示，在西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ[4]對照品色譜峰的保留時間處，供試品溶液具有色譜峰，且色譜峰與相鄰峰得到基線分離，而陰性樣品溶液沒有色譜峰，共存的其他藥味對測定沒有干擾，表明該方法對通腦液中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的測定具有專屬性。對照品、供試品及陰性樣品色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關系考察 精密稱取西紅花苷Ⅰ對照品10.60 mg置于50 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為西紅花苷Ⅰ對照品儲備液。再分別精密量取西紅花苷Ⅰ對照品儲備液0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0置10 mL量瓶中；精密稱取西紅花苷Ⅱ對照品12.80 mg置于100 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為西紅花苷Ⅱ對照品儲備液。再分別精密量取西紅花苷Ⅱ對照品儲備液0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0分別置上述10 mL量瓶中，用稀乙醇定容，搖勻，即得系列濃度西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ對照品混合溶液。分別精密吸取西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ對照品系列濃度混合溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。實驗表明，西紅花苷Ⅰ在9.66～ 57.94 μg·mL-1濃度范圍內峰面積與進樣濃度的關系為：A= 26.717C– 0.0693（r= 1），西紅花苷Ⅱ在5.91 ～35.48 μg·mL-1濃度范圍內峰面積與進樣濃度的關系為：A= 28.673C– 7.1746（r= 0.9999），表明西紅花苷Ⅰ在9.66 ～ 57.94 μg·mL-1范圍內線性關系良好，西紅花苷Ⅱ在5.91 ～ 35.48 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.5.2 精密度實驗 按“2.3”項下方法配制西紅花苷Ⅱ對照品儲備液。分別精密吸取上述儲備液各1.0 mL于10 mL量瓶中，用稀乙醇定容，搖勻，即得。進樣，按“2.2”項下方法進行分析，重復進樣6次，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD。實驗表明，西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD分別為0.36%（n= 6）和1.02%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性實驗 取同一批樣品（批號：20150415）6份，按“2.3”項下方法制備，依法測定，記錄色譜圖。實驗結果表明，通腦液中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量平均值分別為131.24 μg·mL-1（RSD = 1.02%，n= 6）和50.17 μg·mL-1（RSD = 1.75%，n= 6），表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩定性實驗 取同一批樣品（批號：20150415）制備的供試品溶液，分別于0、2、4、6、10、12 h進樣測定。實驗結果表明，通腦液中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD分別為0.47%（n= 6）和1.79%（n=6），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

2.5.5 回收率實驗 精密稱取西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ對照品稀釋制成濃度分別為93.29 g·mL-1和56.62 g·mL-1的加樣用西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ溶液。分別取0.8、1.0、1.2 mL加樣用西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ溶液按低（80%）、中（100%）、高（120%）三個劑量組置于10 mL量瓶再分別精密稱取同一批已知含量的樣品（批號：20150415）9份，每份0.5 mL，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻后依法測定，記錄色譜峰值。結果表明該法適用于西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量測定，見表1。

表1 西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ加樣回收率實驗結果. n = 9Tab 1 Results of recovery test for crocinⅠand crocinⅡ. n = 9

2.6 含量測定

取通腦液三批樣品（批號：20141117；20150309；20150415）按供試品溶液制備方法項下制備，依法測定峰面積，按外標法計算西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量[5-7]。測定數據與結果見表2。

表2 西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量測定結果. n = 3Tab 2 Contents determination of crocinⅠand crocinⅡ. n = 3

3 討論

3.1 通腦液指標成分及含量測定方法的選擇

君藥之一西紅花為鳶尾科植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭，性味甘、平，歸心、肝經，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效[1]。國內外大量研究表明，西紅花提取物在抗心血管系統疾病、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、防治糖尿病并發癥等方面有明確的生物活性[2-3]，其藥理作用明顯，開發潛力大，頗受醫藥界青睞。2010年版《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》未對通腦液進行含量測定，及未對制劑中組成成分石菖蒲、水蛭進行鑒別。 根據《中國藥典》[3]、參考相關文獻[4-8]及課題專家審批建議，選定處方組成中的君藥西紅花的有效成分西紅花苷Ⅰ、Ⅱ作為指標成分，采用HPLC法對其進行含量測定，本實驗所建立的方法操作簡便、專屬性強，精密度、重復性、回收率均滿足要求，可作為通腦液的質量控制方法。

3.2 通腦液含量限度的確定

本制劑為中藥制劑，進行含量限度測定須注意：在保證藥物成分對臨床安全和療效穩定的情況下，并基于足夠的具有代表性的樣品實驗數據，結合藥材含量及工藝收率綜合分析制定。我們所測成分的原料為粉末、提取物入藥，該成分的轉移率應不低于85%，且所測成分的原料在制備工藝中經溶劑提取時，該成分轉移率一般應不低于30%。

3.3 HPLC法測定條件的優化

3.3.1 檢測波長選擇 參考文獻[5,9]并采用二級管陣列檢測器（DAD）進行全波長掃描顯示，西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ在440 nm波長范圍處有最大吸收，因此選擇440 nm作為檢測波長。

3.3.2 流動相的選擇 經過多次實驗確定了以甲醇-水（48 : 52）為西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量測定的流動相，峰形好，西紅花苷Ⅰ理論塔板數達5000以上，可作為通腦液的質量控制方法。由于西紅花苷Ⅰ、Ⅱ的結構中有多個共軛雙鍵，對pH、光照、溫度、氧等影響因素十分敏感，穩定性差[2,7]，因此在實驗中應保持溫度不變，所以選擇柱溫與外界溫度相一致。

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Quality standard studies of Tongnaoye

WANG Xiu-qin, QIAN Qiu-yu, WANG Dong-xing, SHI Lei, CHEN Jun(Pharmacy of 263 Clinical Department of the Army General Hospital, Beijing 101149, China)

Objective:To establish the quality standard of Tongnaoye.Methods:Thin layer chromatography (TLC) was used to identify crocus sativus in the prescription. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the content of crocin Ⅰ and crocin Ⅱ. Chromatographic conditions were as follows: Agilent ZORBAX SB-C18column (250 mm × 4.6 mm,5 μm) was used, the mobile phase consisted of methanol-water (48 : 52) with the fl ow rate of 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was set at 440 nm, the temperature was 30 ℃ and the sample volume was 10 μL.Results:The TLC method showed good specif i city and separation effect. CrocinⅠshowed a good linear relationship (r = 1) in the range of 9.66 – 57.94 μg·mL-1, while crocinⅡ showed a good linear relationship (r = 0.9999) in the range of 5.91 – 35.48 μg·mL-1. Their average recovery rates were 98.4% (RSD = 1.21%, n =9) and 99.4% (RSD = 1.70%, n = 9) respectively.Conclusion:This method was simple, accurate and reproducible, which could be used to control the quality of Tongnaoye.

R917

A

1672 – 8157(2017)05 – 0271 – 04

軍隊十二五面上項目（14ZJZ06-1）

王東興，男，主管藥師，研究方向：藥品分析與藥品質量控制。E-mail：13910864566@139.com

王秀琴，女，副主任藥師，主要從事藥事管理及臨床藥學工作。E-mail：wangxq69@163.com

2017-04-10

2017-06-06）