不同產(chǎn)地刺五加藥材高效液相色譜指紋圖譜研究

羅 旭，唐小龍，楊宋琪，陳海燕，柯 瀟

（四川濟生堂藥業(yè)有限公司，四川 成都 611930）

不同產(chǎn)地刺五加藥材高效液相色譜指紋圖譜研究

羅 旭，唐小龍，楊宋琪，陳海燕，柯 瀟

（四川濟生堂藥業(yè)有限公司，四川 成都 611930）

目的建立繪制刺五加藥材指紋圖譜的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為Agilent HC－C18(2)柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相為乙腈 －水（梯度洗脫），檢測波長為210 nm，柱溫為35℃，流速為1.0 mL／s，分析時間為60 min。結(jié)果刺五加色譜圖中共標示14個色譜峰，用指紋圖譜相似度軟件測定10批刺五加藥材指紋圖譜的相似度均在0.90～1.00之間。結(jié)論該方法準確，重復(fù)性好，可為刺五加藥材的質(zhì)量控制提供有力依據(jù)。

刺五加；高效液相色譜法；指紋圖譜；相似度

以刺五加藥材為原料的制劑較多，如刺五加注射液、刺五加腦靈液、救爾心膠囊、刺五加膠囊、刺五加片等。刺五加也是我公司產(chǎn)品舒肝解郁膠囊的主要成分之一，為五加科植物刺五加 Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.） Harms 的干燥根和根莖或莖[1]，主要分布在我國東北和河北、山西等地，具有益氣健脾、補腎安神的功效，用于治療脾腎陽虛、體虛乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多夢等癥[2]。刺五加主要含苷類、糖類、皂苷類等多種化學成分[3－4]，其中刺五加糖苷類是抗疲勞、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老的主要生物活性成分[5－8]。目前，中藥指紋圖譜對于推動中藥現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化、國際化具有重大作用。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法繪制了刺五加藥材的指紋圖譜，為刺五加藥材的整體質(zhì)量控制提供了有效方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀，含Agilent Chemstation化學工作站（美國安捷倫公司）；BP－211D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ250DE型超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司）。

1.2 試藥

紫丁香苷對照品（批號為111574－201504，純度為94.9%），刺五加苷 E對照品（批號為111713－201403，純度為 98.1%），異嗪皮啶對照品（批號為 110837－201206，純度為99.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（美國Fisher公司）為色譜純；水為超純水，甲醇為分析純；刺五加藥材采購于黑龍江伊春不同產(chǎn)地，由成都康弘藥業(yè)集團國家企業(yè)技術(shù)中心葉亮教授鑒定為五加科植物刺五加 Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms的干燥根和根莖或莖（批號分別為160901， 160902， 160903， 160904， 160905， 160906，160907，160908，160909，160910）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC －C18(2)柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的條件進行梯度洗脫；檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL ／s。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

供試品溶液：取本品粉末（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

參照物溶液：取紫丁香苷對照品、刺五加苷E對照品、異嗪皮啶對照品，精密稱定，加甲醇（刺五加苷E先加50%甲醇溶解）分別制成每1 mL含紫丁香苷20，20，5 μg 的溶液，即得。

2.3 測定方法與方法學考察

分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄55 min的色譜圖。

精密度試驗：取刺五加藥材，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下，連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖。結(jié)果各色譜峰的相對保留時間和其相對峰面積比值一致，RSD均小于3.0%，達到指紋圖譜技術(shù)要求。

重復(fù)性試驗：精密稱取刺五加藥材5份，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下進行分析并記錄色譜圖。結(jié)果各色譜峰的相對保留時間和其相對峰面積比值一致，RSD均小于3.0%，達到指紋圖譜技術(shù)要求。

穩(wěn)定性試驗：精密稱取刺五加藥材，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下，分別于 1，8，16，24，48 h 時記錄色譜圖。結(jié)果各色譜峰的相對保留時間和其相對峰面積比值一致，RSD均小于3.0%，達到指紋圖譜技術(shù)要求。

2.4 指紋圖譜共有指紋峰標定

根據(jù)10批不同產(chǎn)地的刺五加供試品指紋圖譜的檢測結(jié)果（圖1），總結(jié)出供試品指紋圖譜的14個典型色譜峰（圖2），其中6號峰為紫丁香苷色譜峰。紫丁香苷是刺五加的有效成分之一，將其作為內(nèi)參比峰，各峰相對保留時間、相對峰面積結(jié)果見表2。

圖1 10批刺五加藥材指紋圖譜

圖2 刺五加標準指紋圖譜

2.5 指紋圖譜相似度檢驗

采用國家藥典委員會開發(fā)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”，該軟件有生成對照圖譜功能，并進行相似度計算。根據(jù)10批刺五加藥材色譜指紋圖譜建立的共有模式，利用指紋圖譜相似度計算軟件，以夾角余弦作為測度，計算樣品與共有模式的相似度。結(jié)果見表3。

表2 各批次刺五加相對保留時間和相對峰面積

表3 10批刺五加指紋圖譜相似度檢驗結(jié)果

3 討論

3.1 參照物的選取

現(xiàn)代化學成分及藥理試驗表明，刺五加糖苷類是刺五加的主要活性成分之一，故選定紫丁香苷作為參照物。

3.2 刺五加粉碎度的確定

試驗中考察了3種粉碎粒度即粗粉、細粉和超細粉，依法操作，所得圖譜一致，本試驗中選用細粉。

3.3 色譜條件的選擇

流動相：本試驗中比較了不同比例甲醇－水、乙腈 －水、甲醇 －0.1%冰醋酸、乙腈－0.1%冰醋酸4種溶劑系統(tǒng)進行梯度洗脫，結(jié)果以乙腈－水溶劑系統(tǒng)所得圖譜的峰形較好、分離度大，故選用乙腈－水系統(tǒng)為本試驗流動相系統(tǒng)。

色譜柱：本試驗中考察了3種不同色譜柱，即Shimadzu VP －ODS 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Agilent HC －C18(2)柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Phenomenex Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），進行梯度洗脫。結(jié)果表明，Agilent HC －C18(2)柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）色譜柱的基線最平穩(wěn)，峰數(shù)最多，且分離度最好，因此最終選擇 Agilent HC －C18(2)柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為本研究的色譜柱。

測定波長：試驗對比了 210，250，270，320 nm 波長的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在210 nm波長處測定的色譜圖出峰較多，反映的信息量較完全，故采用210 nm作為檢測波長。

3.4 方法評價

本試驗中將10批刺五加的指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”。結(jié)果表明，10批刺五加藥材的相似度均大于0.9，相似度較好。本試驗中共用了10批藥材，保證了樣本量及試驗方法的代表性，故可通過本方法制訂標準指紋圖譜來控制刺五加的藥材質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：206－207.

[2]中國醫(yī)學科學院藥物研究所.中藥志[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：25－30.

[3]吳立軍，鄭 健，姜寶虹，等.刺五加莖葉化學成分[J].藥學學報，1999，34（4）：294 － 296.

[4]潘海峰，孟艷彬，繆 紅.刺五加的研究概況[J].承德醫(yī)學院學報，2002，19（2）：157 －159.

[5]鄭日男，金海艷，裴風郁.刺五加對胃缺血再灌注損傷防護作用的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合脾胃雜志，1998，6（4）：226－228.

[6]張敬一，楊惠敏，付琳杰，等.刺五加多糖對小鼠Lewis肺癌的實驗性干預(yù)作用研究[J].癌變 畸變 突變，2001，13（4）：270.

[7]黃力平，許豪文，曲 鐳，等.維生素E和復(fù)方刺五加液對小白鼠疲勞性游泳運動的作用[J].中華物理醫(yī)學雜志，1998，20（2）：84.

[8]王榮光，王霞文.五味子和刺五加抗衰老作用探討[J].中藥藥理與臨床，1991，7（6）：31.

HPLC Fingerprint of Acanthopanax Senticosus from Different Habitats

Luo Xu，Tang Xiaolong，Yang Songqi，Chen Haiyan，Ke Xiao
（Sichuan Jishengtang Pharmaceutical Co.Ltd.，Chengdu，Sichuan，China 611930）

Objective To establish the HPLC fingerprint of Acanthopanax senticosus.Methods The chromatographic column was Agilent HC － C18（2） column （250 mm × 4.6 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitrile－ water （gradient elution），the detection wavelength was 210 nm，the column temperature was 35 ℃ ，the flow rate was 1.0 mL ／s and the analysis time was 60 min.Results Fourteen chromatographic peaks were identified in the chromatogram of Acanthopanax senticosus，and the similarity of the fingerprints of the 10 batches of Acanthopanax senticosus was determined by fingerprint similarity software was in the range of 0.90 － 1.00.Conclusion The method is accurate and reproducible，which can provide a strong basis for the quality control of Acanthopanax senticosus.

Acanthopanax senticosus；HPLC；fingerprint；similarity

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2017)20－0006－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.002

四川省重大產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新專項[2012CD00082]；四川科技成果轉(zhuǎn)化項目[2012SC0029]。

羅旭（1980－），男，大學本科，高級工程師，研究方向為中藥質(zhì)量標準，（電話）028－64287669（電子信箱）014449＠cnkh.com。

柯瀟（1983－），男，碩士研究生，高級工程師，研究方向為中藥新藥，（電子信箱）Txzz＠cnkh.com。

2017－05－23)