響應面法優化徐長卿中丹皮酚提取工藝研究

郭伊霖，宗時宇，浦益瓊，徐本亮，王 冰

（上海中醫藥大學，上海 201203）

響應面法優化徐長卿中丹皮酚提取工藝研究

郭伊霖，宗時宇，浦益瓊，徐本亮，王 冰

（上海中醫藥大學，上海 201203）

目的利用響應面法優選徐長卿中丹皮酚的最佳提取工藝。方法采用水蒸氣蒸餾法提取徐長卿中丹皮酚，采用響應面法優選提取工藝，以浸泡時間（A）、液料比（B）、氯化鈉量（C）為自變量，以歸一值(OY值，Y）為因變量，分別進行多元線性方程回歸和二次多項式方程擬合，優選最佳提取工藝并進行驗證。結果最佳提取工藝為浸泡時間3 h，料液比1∶15，氯化鈉量150 g／kg。結論該優選工藝可用于徐長卿中丹皮酚的提取，方法簡便、穩定、可行。

響應面法；水蒸氣蒸餾法；徐長卿；丹皮酚；提取工藝

中藥徐長卿為蘿摩科植物徐長卿 Cynanchum paniculatum（Bge.） Kitag.的干燥根和根莖，性溫，味辛，具祛風化濕、止痛止癢、溫經通絡、活血解毒、利水消腫之功效，常用于治療風濕痹痛、胃痛牙痛、跌打損傷、濕疹、蕁麻疹等癥[1]。徐長卿藥材中揮發油含量較高，其中丹皮酚的含量高達94.7%，是主要活性成分[2]。丹皮酚具有顯著的抗炎、抗變態反應作用，對脾臟、胸腺等免疫器官及淋巴細胞、單核細胞等免疫分子均有顯著調節作用[3]。盡管丹皮酚可化學合成，但市售的丹皮酚提取物多來源于徐長卿、牡丹皮等中藥材，制得的丹皮酚不僅純度高而且安全性好[4]。因此，需進一步改進其提取工藝，以更好地滿足臨床需求。

丹皮酚是小分子酚類化合物，熔點低，易揮發，水溶性差。徐長卿中丹皮酚的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、超聲波輔助提取法、CO2超臨界流體萃取法及溶劑浸潤提取法等[5]。其中，溶劑浸潤提取法耗費溶劑且提取物純度低，CO2超臨界流體萃取法的設備投資成本高，超聲波輔助提取法尚未完善中試放大工藝，而水蒸氣蒸餾法則不需要特殊儀器，既適用于小型實驗室制備，又方便投入大生產，最重要的是可直接獲得丹皮酚晶體，且晶體純度較高，整體成本非常低[6]。因此，本研究中擬選用水蒸氣蒸餾提取法，利用響應面分析法優選徐長卿中丹皮酚的最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜系統（安捷倫科技公司）；DZF－6050型真空干燥箱（上海博訊實業有限公司）；KH－400KDB型高功率數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；TGL－20B型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；XS105DU型電子分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；BS124S型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；電熱套（江蘇近湖鎮教學儀器廠）；蒸餾裝置（上海青陽生物科技有限公司）。

1.2 試藥

丹皮酚對照品（批號為110708－201407，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，安徽時聯特種溶劑股份有限公司）；試驗用水為純凈水（杭州娃哈哈百立食品有限公司）；氯化鈉（分析純，批號為 20160428，國藥集團化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。徐長卿飲片（批號為150613）購自上海康橋中藥飲片有限公司，經上海中醫藥大學張紅梅博士鑒定為徐長卿Cynanchum paniculatum（Bge.） Kitag.。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法建立

2.1.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Ultimate? XB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 水（65 ∶35），流速：1.0 mL ／min；檢測波長：274 nm；柱溫：25℃。理論板數按丹皮酚峰計算應不低于5 000。

2.1.2 溶液制備

對照品貯備液：稱取丹皮酚對照品10.38 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，搖勻，制得質量濃度為207.6 μg／mL的對照品貯備液，于4℃保存。

供試品溶液：稱取丹皮酚結晶，精密稱定，用甲醇溶解稀釋至一定質量濃度，0.45μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：精密稱取一定量丹皮酚結晶，按2.2項下方法制備供試品溶液。分別取空白甲醇溶液、供試品溶液及對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，利用高效液相色譜（HPLC）系統測定。結果空白甲醇對丹皮酚的測定無干擾。結果見圖1。

線性關系考察：取對照品貯備液，用甲醇逐級稀釋成 質 量 濃 度 為 5.19， 10.38， 20.76， 41.52， 83.04，166.08 μg／mL 的系列溶液，搖勻，作為對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液各10 μL，分別注入HPLC儀，記錄峰面積，以質量濃度（X，μg／mL)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線(見圖2)，回歸方程 Y＝51.763 X＋14.162，r＝1.000(n＝6)。結果表明，丹皮酚質量濃度在5.19～166.08μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取質量濃度為 5.19，41.52，166.08 μg／mL 的對照品溶液，按 2.1 項下色譜條件，1 d內連續重復進樣6次，連續測定3 d，記錄峰面積。結果低、中、高質量濃度對照品溶液色譜日內精密度的RSD 依次為 0.53% ，0.20% 和 0.31% ，日間精密度的RSD 依次為 2.80% ，0.87% 和 0.47% ，RSD 均小于3.00%，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批樣品，依法平行制備6份供試品溶液，進樣測定。結果的 RSD為2.30%(n＝6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于室溫放置 0，2，4，6，8，12，24 h 時進樣測定。結果峰面積的RSD為1.10%(n＝7)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：精密稱取適量已知純度（94.10%）的丹皮酚結晶，平行9份，每3份為1組，分低、中、高濃度3組，分別加入相當于樣品含量的50%，100%，150%的丹皮酚對照品溶液，用甲醇溶解稀釋至線性范圍，按2.1項下色譜條件測定丹皮酚的含量，并計算低、中、高3種質量濃度的加樣回收率。結果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 徐長卿中丹皮酚含量測定

按照 2015年版《中國藥典（一部）》方法，稱取約0.5 g徐長卿飲片粗粉，置100 mL具塞錐形瓶中，平行取3份，分別精密加入50 mL甲醇，稱定質量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取1 mL續濾液，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。以2.1項下色譜條件測定徐長卿飲片中丹皮酚的含量。結果顯示，該批徐長卿中丹皮酚含量為1.68%（RSD ＝1.90%），符合藥典規定。

2.3 提取工藝考察

2.3.1 提取工藝

稱取約40 g徐長卿粗粉，置1 000 mL圓底燒瓶中，加入一定量的蒸餾水和氯化鈉浸潤一定時間后，進行水蒸氣蒸餾，至再無渾濁餾出液滴出時停止蒸餾，將餾出液重蒸餾，收集餾出液于4℃冷藏、靜置48 h后，抽濾收集結晶，25℃干燥稱重，即得丹皮酚結晶[7]。

表1 加樣回收試驗結果（n＝9）

2.3.2 響應面法優化提取工藝

采用Box－Benhnken設計BBD－響應面法，以丹皮酚純度（Y1）和丹皮酚得率（Y2）為指標，料液比、浸泡時間、NaCl加入量為影響因素，使用 Design Expert 8.0.6軟件設計試驗方案及對結果進行分析，優化篩選丹皮酚的最佳提取工藝。因純度與得率均是越高越好，故本試驗中采用總評“歸一值（OY）”法進行綜合考察。因素與水平見表2。

表2 響應面設計因素水平表

利用軟件 Design Expert 8.0.6[8－10]設計出 17 組試驗，其中包括12個析因點試驗和5個用于估計試驗誤差的中央點重復試驗。結果顯示，丹皮酚的得率為0.74% ～ 1.06% ，且純度均高于 90.00% ，最高可達98.39%。具體試驗設計及結果見表3。

對OY值[OY＝（Y1／Y1max）×0.9＋（Y2／Y2max）×0.1]，進行多元線性方程回歸和二次多項方程擬合，得響應值OY對自變量的二次多項回歸方程：

繪制上述擬合回歸方程的三維效應面和二維等高圖，見圖2。優選出丹皮酚提取的最佳工藝為料液比1∶15，NaCl量 6 g（150 g ／kg），浸泡時間 3 h。由于每個因素只有3個水平，因此選擇BBD－響應面法較星點設計CCD－響應面法更經濟、高效，減少試驗次數的同時，又保證了試驗精度[11]。

表3 響應面分析方案及試驗結果

2.4 最優提取工藝條件驗證

以選出的最佳提取工藝，分別進行3組平行驗證試驗。結果見表4。實測值與預測值偏差較小，說明建立的模擬回歸方程預測性較好，其所優選出的最佳提取工藝重復性良好（RSD＜3.00%），該工藝所獲得的結晶純度可達95.60%，說明提取獲得的丹皮酚純度較高。

表4 預測值與實際值的比較

3 討論

響應面法是采用非線性數學模型進行擬合，用三維效應面進行優化來預測最佳試驗條件，精度高、預測性好、簡便，解決了正交試驗設計只能對孤立的試驗點進行分析，無法找出整個區域的最佳組合缺點[12]。本研究中采用BBD－響應面分析法，建立模擬回歸方程，并繪制響應值 OY對自變量的效應面，從而成功優選出徐長卿中丹皮酚的最佳提取工藝：料液比為1∶15，NaCl量為150 g／kg，浸泡時間為3 h。該工藝不僅穩定可行，且獲得的丹皮酚結晶純度高（95.60%），可為后期的制劑研究及藥效評價提供高純度樣品制備方法，及為課題后續開展提供試驗依據。

圖2 各因素間的響應面圖和等高線圖

[1]江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上海科學技術出版社，2000：1894 － 1895.

[2]付 明，王登宇，胡 興，等.徐長卿化學成分研究 [J].中藥材，2015，38（1）：97 － 100.

[3]朱 娜，李見春，張文靜，等.徐長卿藥材中丹皮酚超聲提取工藝研究[J].亞太傳統醫藥，2015，11（2）：37 － 38.

[4]江書慶，信建豪.牡丹皮中丹皮酚水蒸汽提取研究[J].亞太傳統醫藥，2014，10（1）：28 － 29.

[5]耿 帥，趙育林，曾 凱，等.丹皮酚的研究進展[J].中國新藥與臨床雜志，2016，35（5）：310 － 313.

[6]翟科峰，段 紅，曹穩根，等.響應面法優化徐長卿中丹皮酚的提取工藝[J].宿州學院學報，2016，31（4）：122 －126.

[7]Cai H，Qin KM，Liu X，et al.Current research status and relevant thoughts on quality standardization of Chinese herbak pieces[J].World Sci Tech Mod Tradit Chin Med，2011，13（3）：450 － 456.

[8]Guo JH， Zhang K，Zhang TJ，et al.Optimum technology of homogenated extraction for fresh rehmannia by central composite design － response surface methodology[J].Chin J Mod Appl Pharm，2015，32（2）：148 － 152.

[9]Dong XX，Fu J，Yin XB，et al.Study of paeonol extraction process and inclusion process from Cortex Moutan[J].World J Integr Trad West Med，2015，10（1）：37 － 39.

[10]You QH，Yin XL.Optimization of extraction of phellinus igniarius polysaccharides using response surface methodology[J].China Brewing，2010，29（5）：67 － 69.

[11]余小翠，劉高峰.響應面分析法在中藥提取和制備工藝中的應用[J].中藥材，2010，33（10）：1651 － 1655.

[12]施 昶，沈詩思，黃海飛，等.星點設計－效應面優化法在處方篩選和優化中的應用[J].機電信息，2014（32）：41 －46.

Optimization of Extraction Process of Paeonol in Cynanchum Paniculatum by Response Surface Method

Guo Yilin，Zong Shiyu，Pu Yiqiong，Xu Benliang，Wang Bing
（ Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai， China 201203）

Objective To optimize the extraction process of paeonol in Cynanchum paniculatum by response surface method（RSM）.Methods The paeonol was extracted in Cynanchum paniculatum by steam distillation.The extraction process was optimized by RSM，the effect of extraction time （A），ratio of liquid to material （B） and amount of sodium chloride （C） as the independent variable，OY Value（Y） as the dependent variable，the multiple linear equation regression and the quadratic polynomial equation fitting were carried out respectively，and the optimal extraction process was selected and validated.Results The optimal extraction conditions were as follows：immersion time was 3 h，ratio of material to liquid was 1 ∶15，and sodium chloride was 150 g ／kg.Conclusion The optimization process can be used to extract paeonol in Cynanchum paniculatum，the method is simple，stable and feasible.

response surface method；steam distillation； Cynanchum paniculatum；paeonol；extraction process

TQ460.6；R284.1

A

1006－4931(2017)20－0009－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.003

上海市教育委員會預算內科研項目[2014YSN28]。

郭伊霖，在讀碩士研究生，研究方向為中藥學，（電話）021－51322352（電子信箱）gyl101010＠126.com。

王冰，博士研究生，副教授，研究方向為中藥納米給藥系統，（電話）021－51323123（電子信箱）annabel＿cn＠163.com。

2017－06－06)