鹵素水分測定法結合高效液相色譜法優選婦科灌腸液提取工藝的研究

劉鳳樂 ，邱 遜 ，高文全 ，王蕊蕊 ，趙桂芬 ，楊 磊 ，趙愛梅

（1.云南省大理白族自治州中醫醫院，云南 大理 671000； 2.云南省大理市第一人民醫院，云南 大理 671000）

鹵素水分測定法結合高效液相色譜法優選婦科灌腸液提取工藝的研究

劉鳳樂1，邱 遜1，高文全1，王蕊蕊1，趙桂芬1，楊 磊2，趙愛梅1

（1.云南省大理白族自治州中醫醫院，云南 大理 671000； 2.云南省大理市第一人民醫院，云南 大理 671000）

目的優選婦科灌腸液的提取工藝。方法采用鹵素水分測定法和高效液相色譜（HPLC）法，以浸膏得率和鹽酸小檗堿含量為指標，通過正交試驗設計，對提取工藝中加水量（A）、提取時間（B）、提取次數（C）3個因素進行考察，以優選最佳提取工藝。結果最佳提取工藝條件為加10倍量水，煎煮3次，每次1 h。結論該方法可作為婦科灌腸液的提取工藝。

婦科灌腸液；正交試驗；提取工藝；鹽酸小檗堿；浸膏得率

婦科灌腸液是根據云南省大理白族自治州中醫醫院臨床驗方研制的院內中藥制劑，由黃柏、苦參、魚腥草、丹參、川芎、敗醬草、薏苡仁等中藥組方，具有活血化瘀、清熱利濕、理氣止痛之功效，臨床應用10多年，主要用于治療急慢性盆腔炎。方中黃柏為君藥，其味苦，性寒，歸腎、膀胱、大腸經，功能清熱燥濕、瀉火解毒、除骨蒸，用于治療濕熱帶下、熱淋澀痛、濕熱瀉痢、黃疸、瘡瘍腫毒，濕疹瘙癢等癥[1]。大量研究表明，黃柏具有廣泛的抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌等生物學和藥理活性，鹽酸小檗堿是其主要有效成分之一[2－6]。本試驗中參考文獻[7－8]，以浸膏得率、鹽酸小檗堿含量為提取工藝指標，采用正交試驗設計優選其提取工藝[9－10]，為研究制劑的成型工藝提供試驗依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，配G1311B四元梯度泵，G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱，G1315D二極管陣列檢測器(美國安捷倫科技有限公司）；AR423DCN型電子天平，DV215CD型電子分析天平，MB45型鹵素水分測定儀（美國奧豪斯儀器有限公司）；C21－ST2118型電磁爐（廣東美林生活電器有限公司）；PS－30型超聲波清洗儀（深圳市潔康洗凈電器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110713－201212）；中藥材購于云南白藥集團股份有限公司中藥飲片分公司，經云南省大理白族自治州中醫醫院趙愛梅副主任藥師鑒定，均符合2015年版《中國藥典（一部）》標準規定；乙腈（色譜純，美國天地公司）；甲醇（色譜純，美國飛世爾公司）；磷酸（分析純，天津福晨化學試劑廠）；水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 鹽酸小檗堿含量測定

2.1.1 色譜條件[11－12]

色譜柱：Zorbax SB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A） －0.2% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫，0～24 min，10% ～50%A；流速：1 mL ／min；柱溫：30℃；檢測波長：265 nm；進樣體積：5 μL。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：稱取鹽酸小檗堿對照品9.97 mg，精密稱定，置 10 mL容量瓶中，加鹽酸 －甲醇（1∶100）定容至刻度，搖勻，制成對照品母液。再吸取對照品母液1 mL，置 10 mL容量瓶中，加鹽酸 －甲醇（1∶100）定容至刻度，搖勻，制成含量為0.099 7 g／mL的對照品溶液。

供試品溶液：依處方組成配比稱取藥材，平行稱取9 份，浸泡 30 min，按 L9（34）試驗表進行煎煮提取，提取液濾過，合并濾液，濃縮，定容，作為樣品溶液。精密吸取樣品溶液10 mL，至具塞磨口玻璃瓶中，再加入15 mL鹽酸 － 甲醇（1 ∶100），振搖，稱定質量，超聲 30 min，再稱定質量，補足減失的質量。吸取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得各提取液的供試品溶液。

陰性對照品溶液：精密吸取缺黃柏的陰性樣品溶液10 mL，按供試品溶液制備方法制備缺黃柏的陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取 2.1.2項下 3種溶液各5 μL，照 2.1.1 項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液色譜中鹽酸小檗堿與相鄰色譜峰分離度＞1.5，理論板數按鹽酸小檗堿計算不低于50 000，陰性對照無干擾，詳見圖1。

線性關系考察：精密吸取 2.1.2項下對照品溶液(0.099 7 g ／mL)，按 2.1.1 項下色譜條件分別進樣 1，3，5，7，9，11 μL，測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y＝4 310.9 X＋20.326， r＝1.000 0(n＝6)，進樣量線性范圍為 0.099 7 ～ 1.096 7 μg。

精密度試驗：精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液5 μL，連續進樣 6 次。結果的 RSD 為 0.70%(n ＝6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取正交試驗7號樣品溶液10 mL，制備供試品溶液，按照 2.1.1項下色譜條件，分別于 0，2，4，6，12，24 h 時進樣 5 μL。結果鹽酸小檗堿峰面積的 RSD為0.65%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：精密吸取正交6號樣品溶液，平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件，進樣測定。結果鹽酸小檗堿含量均值為 97.72 μg／mL， RSD 為1.69%(n＝6)，表明方法重復性較好。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量的樣品溶液（鹽酸小檗堿含量為 0.135 g／L）2 mL，共 9 份，置 10 mL 棕色瓶中，分別精密加入低、中、高質量濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液（0.56 g ／mL）0.4，0.5，0.6 mL 各 3 份，制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為98.00%，97.00%和99.00% ，RSD 分別為 0.82%，0.63% 和 1.22%(n ＝9)，表明方法的回收較好。

圖1 婦科灌腸液高效液相色譜圖

2.2 水提工藝條件優選

2.2.1 正交試驗設計

根據煎煮法的條件選擇加水量（因素A）、提取時間（因素B）及提取次數（因素C）3個條件為考察因素，各因素根據實際情況均取3個水平，以提取物鹽酸小檗堿含量和干浸膏得率為評價指標，用 L9（34）安排試驗，因素水平表見表1。

表1 水提工藝條件優選因素水平表

2.2.2 浸膏得率測定

分別精密吸取9組正交樣品溶液1 mL，分別置鹵素水分測定儀，按已設定測量條件（溫度程序：階梯；干燥溫度：0～4 min，升至 200℃，4 min后降至 105℃；關閉模式：60 min；測量時間：5 min），測出含水量，計算浸膏得率。

表2 正交試驗設計及結果(n＝9)

2.2.3 結果與分析

根據正交試驗設計，計算鹽酸小檗堿含量和浸膏得率，進行多指標綜合加權評分，結果見表2。為進一步確定各因素對結果的影響大小，對試驗結果進行方差分析，結果見表3。由極值和方差分析表可以得出，影響婦科灌腸液提取的工藝因素的強度依次為C（提取次數）＞A（加水倍數）＞B（煎煮時間），且提取次數為顯著性影響因素（P＜0.05），因素A和因素B對試驗結果無顯著性影響。因此確定各因素的最佳水平組合為A2B2C3，即煎煮3次，每次加10倍量水，每次1 h。

表3 方差分析表

2.2.4 工藝驗證試驗

分別稱取5倍量的處方藥材，共3份，按優選的提取工藝A2B2C3進行驗證試驗。結果見表4，其 RSD為1.6%，表明優選出的工藝條件穩定，合理可行。

表4 提取工藝驗證試驗結果(n＝3)

3 討論

正交試驗的極差分析結果顯示，提取次數對試驗有顯著性影響，故就提取次數進行追加，結果顯示與最佳提取工藝（A2B2C3）無顯著性差異，再從生產的綜合效益出發，考慮到節能降耗、縮短生產周期等因素，最終確定各因素的最佳水平組合為A2B2C3。

本研究中創新地通過采用鹵素水分測定浸膏得率，測定提取液水分含量，間接得出浸膏得率，且只需耗時約6 min，比傳統的烘箱烘至恒重法大大節省了時間及能源，提高了試驗效率，且試驗準確度更高[13]。

本試驗中考察了乙腈－0.1%磷酸水溶液、乙腈－0.2%磷酸水溶液和乙腈－0.2%磷酸水溶液－磷酸二氫鉀等流動相系統對鹽酸小檗堿成分分離的影響，發現采用乙腈－0.2%磷酸水溶液流動相系統，梯度洗脫，且不用加緩沖鹽（磷酸二氫鉀、十二烷基磺酸鈉等），也能較好地將鹽酸小檗堿色譜峰與其他色譜峰分離，理論板數以鹽酸小檗堿計算不低于50 000。

由于鹽酸小檗堿是該處方中君藥黃柏的主要有效成分，其含量的高低經配伍后對臨床療效影響較大，因此選擇鹽酸小檗堿的含量作為評價指標之一，權重系數較高，以0.7為宜。浸膏得率作為提取工藝的參考指標，能部分反映出該處方藥物的提取質量，但浸膏得率與療效不成正比例關系，故綜合評價時權重系數相應較小，以 0.3為宜[14]。

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Optimization of Extraction Process for Gynecological Enema Liquid by Halogen Moisture Determination and HPLC

Liu Fengle1， Qiu Xun1， Gao Wenquan1， Wang Ruirui1， Zhao Guifen1， Yang Lei2， Zhao Aimei1
（ 1.Dali Hospital of Traditional Chinese Medicine， Dali， Yunnan， China 671000； 2.Dali First People′s Hospital， Dali， Yunnan， China 671000）

Objective To optimize the extraction process for gynecological enema liquid.Methods Halogen moisture determination and HPLC were adopted，with the extracting rate and content of berberine hydrochloride as indexes，water volume （A），extracting time （B）and extracting times （C） as factors，the optimum extraction process was optimized by orthogonal test.Results The optimum process was determined as adding 10 times of water and extracting 1 h for 3 times.Conclusion This method can be used as the extraction process for gynecological enema liquid.

gynecological enema liquid；orthogonal test；extraction process；berberine hydrochloride；extracting rate

TQ460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)20－0017－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.005

劉鳳樂，男，碩士研究生，主管中藥師，研究方向為醫院制劑研發及質量管理，（電話）0872－2196090（電子信箱）lflcpu＠ 163.com。

趙愛梅，女，副主任中藥師，研究方向為中藥質量控制，（電話）0872－2196090（電子信箱）651884308＠qq.com。

2017－06－06)