多指標正交試驗優選丹參川芎復方的提取工藝

施天慧，江 華

（1.江蘇省南通衛生高等職業技術學校，江蘇 南通 226010； 2.江蘇省啟東市人民醫院，江蘇 南通 226200）

多指標正交試驗優選丹參川芎復方的提取工藝

施天慧1，江 華2

（1.江蘇省南通衛生高等職業技術學校，江蘇 南通 226010； 2.江蘇省啟東市人民醫院，江蘇 南通 226200）

目的優選丹參、川芎復方中藥的最佳提取工藝。方法以丹參酮ⅡA、阿魏酸和干膏得率為醇提工藝評價指標，丹酚酸B和干膏得率為水提工藝評價指標，采用正交試驗法篩選最佳提取工藝。結果丹參、川芎飲片，加8倍量的80%乙醇，提取3次，每次1.5 h。醇提后的藥渣揮干乙醇，加8倍量的水，提取3次，每次1.5 h，濾過，合并水煎液，濃縮至相對密度為1.10（60℃熱測），室溫放置，加95%的乙醇使含醇量達65%，靜置過夜，抽濾，回收乙醇至無醇味。結論通過正交試驗優選的丹參川芎復方提取工藝穩定、可行，有效成分提取率高，可為工業化生產提供實驗依據。

丹參；川芎；丹參酮ⅡA；丹酚酸B；阿魏酸；提取工藝；正交試驗

丹參具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩的功效[1]。川芎有活血行氣、祛風止痛的功效[1]。現代藥理研究證實，丹參具有擴張血管、改善微循環、增加心肌供血量和供氧量、降低心肌耗氧量、抗肝纖維化的作用，其中以脂溶性丹參酮為代表的醌類化合物具有明顯的抗炎作用，而以丹參酚酸類為主的水溶性成分是治療心血管疾病的主要成分[2－3]。川芎也具有擴張冠狀動脈、增加冠狀動脈血流量、降低心肌耗氧量的作用，其中起主要作用的是生物堿和酚性成分[4－5]。丹參、川芎合用作為治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病）、心絞痛、腦梗死的重要活血化瘀藥，配伍使用后能增加冠狀動脈流量、提高缺血組織內氧分壓、改善微循環、縮小梗死范圍，是心腦血管成方制劑處方必不可少的藥物[6－10]。本研究中以乙醇提取脂溶性成分，再取藥渣以水提取水溶性成分，通過正交試驗，以丹參酮ⅡA、阿魏酸的提取量及干膏得率為醇提工藝指標，以丹酚酸B的提取量和干膏得率為水提工藝指標進行優選，并進行驗證試驗，確定丹參與川芎的最佳提取工藝，以期為制劑開發、大生產工藝提供有益的實驗室依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient 1200型高效液相色譜儀系統，DAD檢測器(美國安捷倫公司）；Sartorius BT125D型天平(精度為0.01 mg，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；HH－2型數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；DW－2型調溫電熱器（南通市通州申通電熱器廠）；ZK－82B型真空干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）；SENCOR－301型旋轉蒸發器（上海申順生物科技有限公司）；SHB－Ⅲ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；H66025T型超聲波清洗器（無錫超聲電子設備有限公司）。

1.2 試藥

丹參（產地江蘇，徐州彭祖中藥飲片有限公司，批號為130725），川芎（產地四川，徐州彭祖中藥飲片有限公司，批號為131016），經中國藥科大學中藥學院王強教授鑒定為唇形科植物丹參 Salvia miltiorrihiza Bge.的干燥根和根莖，傘形科植物川芎 Ligusticun chuanxiong Hort.干燥根莖；丹酚酸 B對照品（批號為 111562－201313），丹參酮ⅡA對照品（批號為 110766－200416），阿魏酸對照品（批號為110773－201313），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 篩選指標確定

由于有效成分為脂溶性和水溶性，所以考慮先以乙醇提取脂溶部分，再取藥渣以水提取水溶性部分。以丹參酮ⅡA、阿魏酸的提取量及干膏得率為醇提工藝指標；丹酚酸B的提取量和干膏得率為水提工藝指標。

2.2 醇提工藝優選

2.2.1 因素水平設計

根據文獻及預試驗，以丹參酮ⅡA、阿魏酸的提取量及浸膏得率[11－15]為考察指標，考察乙醇體積分數（A）、溶劑量（B）、提取時間（C）、提取次數（D）對提取效果的影響。因素水平見表1。

表1 丹參川芎醇提因素水平表

2.2.2 試驗方法

根據以上因素水平，安排 L9（34）正交設計表。稱取丹參川芎飲片9份各適量（丹參與川芎比為6∶5），按正交設計表的試驗條件進行提取，過濾，藥液回收乙醇減壓濃縮至100 mL，備用。

2.2.3 干膏得率測定

精密量取2.2.2項下的濃縮液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，在低溫蒸干后，減壓干燥至恒重，精密稱定，計算干膏得率。

2.2.4 丹參酮ⅡA含量測定

色譜條件[16]：色譜柱為 Diamonsil－C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇 － 水（75 ∶25）；檢測波長為 270 nm；流速為 1 mL／min；柱溫為 20℃；進樣量為25 μL。理論板數按丹參酮ⅡA峰計算應不低于2 000。

對照品溶液制備：稱取丹參酮ⅡA對照品2.50 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。

供試品溶液制備：稱取干燥的9份樣品各適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲溶解，用甲醇補足減失的質量，過濾，吸取續濾液1 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，即得。

線性關系考察：分別精密吸取對照品貯備液0.2，2.0，4.0，6.0，8.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，定容至刻度，搖勻，分別進樣 25 μL，以質量濃度（C，g／L）為橫坐標，以峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為 A＝69 753.6＋677 501 992.1C，r＝0.999 9(n＝5)，質量濃度線性范圍為 0.1 ～4.0 μg ／mL。

精密度試驗：精密吸取同一丹參酮ⅡA對照品溶液，按色譜條件重復進樣6次。結果峰面積值的 RSD為0.10%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批提取液干膏，依法制備供試品溶液，按色譜條件重復進樣6次。結果丹參酮ⅡA峰面積的 RSD為0.85%(n＝6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12 h 時進樣測定。結果丹參酮ⅡA峰面積的 RSD為0.55%(n＝6)，表明供試品溶液在12 h內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批提取液干膏6份，精密稱定，分別加入對照品適量，按供試品溶液制備方法制備溶液，按色譜條件進樣，測定含量，計算回收率。結果丹參酮ⅡA的平均回收率為100.30%，RSD為0.44%（n＝6）。

2.2.5 阿魏酸含量測定

色譜條件[1]：色譜柱為 Diamonsil－C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇 －1%醋酸水溶液（30∶70）；檢測波長為321 nm；流速為1 mL／min；柱溫為25℃；進樣量為25 μL。理論板數按阿魏酸峰計算應不低于4 000。

對照品溶液制備：稱取阿魏酸對照品 1.00 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。

供試品溶液制備：稱取干燥的9份樣品各適量，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，超聲溶解，搖勻，微孔濾膜濾過，即得。

線性關系考察：分別精密吸取 0.5，1.0，1.5，2.0，5.0 mL，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，分別進樣 25 μL，以質量濃度（C，g／L）為橫坐標、峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程為 A＝58.378 6＋95 285.630 4 C，r＝0.999 9(n＝5)，質量濃度線性范圍為 5 ～50 μg／mL。

精密度試驗：精密吸取同一阿魏酸對照品溶液，按色譜條件重復進樣6次。結果峰面積值的 RSD為0.48%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同批提取液干膏，依法制備供試品溶液，按色譜條件重復進樣6次。結果阿魏酸峰面積的RSD為0.10%(n＝6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h 時進樣測定。結果阿魏酸峰面積的 RSD為0.22%(n＝6)，表明供試品溶液在12 h內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批提取液干膏6份，精密稱定，分別加入對照品適量，按供試品溶液制備方法制備溶液，按色譜條件進樣，測定含量，計算回收率。結果阿魏酸的平均回收率為 102.40%，RSD為1.43%（n＝6）。

2.2.6 正交試驗結果及方差分析

按L9（3）4正交試驗條件進行煎煮提取，共得到9份醇提液，測定丹參酮ⅡA、阿魏酸含量和干膏得率。結果見表2，方差分析見表3。由表 2可見，得膏率的極差數據 RD＞ RA＞ RC＞ RB，優先順序為 D＞A＞C＞B，A1B1C1D1較佳；從丹參酮ⅡA得率來看，優先順序為A＞C＞B＞D，A3B1C1D1較佳；從阿魏酸得率來看，A＞C＞D＞B，A2B1C1D1較佳。由表3可見，因素B對得膏率和阿魏酸得率影響均不大，為節省加熱、濃縮的時間及溶劑，選擇B2。綜合三者，選擇 A2B2C1D1。即以 8倍量 80%的乙醇提取 3 次，每次 1.5 h。

2.3 水提工藝優選

2.3.1 因素水平設計

以丹酚酸B及干浸膏得率[11－16]為考察指標，考察加水量（A）、提取時間（B）、提取次數（C）、浸泡時間（D）對提取的影響。因素水平見表4。

表2 丹參川芎醇提工藝優選正交試驗結果

表3 丹參川芎醇提工藝優選方差分析表

表4 丹參川芎水提因素水平表

2.3.2 試驗方法

根據以上因素水平，安排 L9（34）正交設計表。將前一步醇提后的藥渣按正交表的條件進行煎煮，合并水提液，過濾，減壓濃縮至100 mL，備用。

2.3.3 干膏得率測定

精密量取2.3.2項下的濃縮液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后，減壓干燥至恒重，精密稱定，計算干膏得率。

2.3.4 含量測定

色譜條件[1]：色譜柱為 Diamonsil－C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈 － 0.1% 磷酸（22 ∶78）；流速為 1.2 mL／min；檢測波長為 286 nm；柱溫為 20℃；進樣量為25 μL。理論板數按丹酚酸B峰計算應不低于6 000。

對照品溶液配制：稱取丹酚酸B對照品5.00 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇 －水（8∶2）混合溶液，超聲溶解，放置至室溫后，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液配制：取9份樣品各適量，置25 mL容量瓶中，加甲醇－水（8∶2）混合溶液至刻度，超聲溶解，搖勻，過濾，取續濾液1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇－水（8∶2）混合溶液至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，即得。

線性關系考察：精密吸取對照品溶液 0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80 mL 置 1 mL 容量瓶中，加甲醇 －水（8 ∶2）稀釋至刻度，進樣 25 μL，按上述色譜條件測定，以質量濃度（g／L）為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程為 A＝16 412.771 2 C－58.209 3， r＝0.999 8(n＝6)，質量濃度線性范圍為25 ～ 400 μg ／mL。

精密度試驗：精密吸取同一丹酚酸B對照品溶液，按色譜條件重復進樣6次。結果峰面積值的 RSD為0.10%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批提取液干膏，依法制備供試品溶液，按色譜條件重復進樣6次。結果丹酚酸B峰面積的 RSD為0.33%(n＝6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12 h時進樣測定。結果丹酚酸 B峰面積的RSD為0.70%(n＝6)，表明供試品溶液在12 h內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批提取液干膏6份，精密稱定，分別加入對照品溶液適量，按供試品溶液制備方法制備溶液，按色譜條件進樣，測定含量，計算回收率。結果丹酚酸B的平均回收率為97.83%，RSD為0.45%（n＝6）。

2.3.5 正交試驗結果及方差分析

按 L9（3）4正交試驗條件進行煎煮提取，共得到9份水提液，測定丹酚酸B和干膏得率。結果見表5，方差分析見表6。由表5可見，得膏率的極差數據RB＞RC＞RD＞RA，優先順序為 B＞C＞D＞A，A3B1C2D3最佳；從丹酚酸B的得率來看，優先順序為 C＞B＞D＞A，A2B2C2D3最佳；由表6可見，因素A對得膏率和丹酚酸B得率影響不大。為節省濃縮時間選擇 A2，綜合兩者選擇A2B2C2D3。即加8倍量水，浸泡60 min，提取3次，每次1.5 h。

表5 丹參川芎水提工藝優選正交試驗結果

表6 丹參川芎水提工藝優選方差分析表

2.4 醇沉工藝考察

2.4.1 醇沉含量選擇

取110 g藥材，按最佳提取工藝先醇提后水提，精密吸取水浴濃縮至相對密度為1.10（60℃熱測）的樣品溶液3份各適量，加入95%乙醇使含醇量分別為55%，65%和75%，靜置過夜，濾過，濾液減壓回收乙醇，真空干燥至恒重，得干膏，計算得膏率。干膏用甲醇－水（8∶2）混合溶液溶解，置25 mL容量瓶中，加甲醇－水（8∶2）混合溶液至刻度，搖勻，吸取 1 mL，置 10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，作為供試品溶液，測定丹酚酸B含量。結果見表7。綜合考慮，選擇65%醇沉濃度最宜。

表7 醇沉工藝含醇量優選試驗結果

2.4.2 濃縮液密度選擇

取相對密度分別為 1.05，1.10 和 1.15（60 ℃熱測）的樣品溶液各適量，置三角瓶中，加入95%乙醇使含醇量為65%，靜置過夜，濾過，濾液減壓回收乙醇，真空干燥至恒重，得干膏，計算得膏率。干膏用甲醇－水（8∶2）混合溶液溶解，于25 mL容量瓶中，加甲醇－水（8∶2）混合溶液至刻度，搖勻，吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，作為供試品溶液，測定丹酚酸B含量。結果見表8。綜合考慮，選擇加工溶液濃縮到相對密度為1.1（60 ℃熱測）。

表8 醇沉工藝濃縮液密度優選試驗結果

2.5 最佳工藝確定

取丹參川芎飲片，加8倍量的80%乙醇，提取3次，每次1.5 h。醇提后的藥渣揮干乙醇，加8倍量的水，提3次，每次 1.5 h，濾過，合并水煎液，濃縮至相對密度 1.10（60℃熱測），放置室溫，加 95%的乙醇使含醇量達65%，靜置過夜，抽濾，回收乙醇至無醇味，即得。

2.6 驗證試驗

為確定優選工藝的優劣和穩定性，平行稱取3份飲片，根據最佳提取工藝進行驗證試驗。試驗結果見表9，表明該工藝合理可行、穩定可靠。

表9 最佳工藝驗證試驗結果

3 討論

丹參是本復方中的君藥，其中含量較多且具顯著藥效的成分分別為水溶性丹酚酸B和脂溶性丹參酮ⅡA。川芎中含揮發油、生物堿、酚酸等多種成分，其中酚酸類成分阿魏酸具有清除氧自由基、抗血小板聚集、改善微循環等作用；生物堿類成分川芎嗪含量很少，且易升華；揮發油類 本內酯在提取過程中又易揮發。本研究中發現，將丹參川芎配伍使用，可促進丹酚酸B分布更廣泛、消除減緩、體內作用時間延長，能促使阿魏酸的血藥濃度提高、體內清除加快[6]。因此，選擇丹酚酸B、阿魏酸和丹參酮ⅡA作為提取工藝評價指標性成分。

藥材采用先醇提后水提的方法，醇提干浸膏得率在30%左右。水提后浸膏得率較高，由于水提部分成分復雜，制得的干膏引濕性強，故將水提液濃縮為浸膏后再采用醇沉法去除大量水溶性雜質，干膏得率降低，在14%左右。水提醇沉后對丹酚酸B含量影響不大，還可減少用藥量，便于制劑后減少用藥劑量提高患者用藥依從性。提取過程中應注意，有效成分丹參酮ⅡA、丹酚酸B在濕熱條件下易降解變質，故提取后的浸膏宜真空干燥，且溫度不宜過高。藥材水提液濃縮后加入乙醇沉淀雜質時，乙醇應邊攪拌邊緩緩加入，否則會導致局部乙醇濃度過高，形成絮狀沉淀，不利于過濾并會影響醇沉效果。

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Optimization of Extraction Process forRadix Salviae Miltiorrhizae and Ligusticum Chuanxiong by Multi－Index Orthogonal Test

Shi Tianhui1，Jiang Hua2
（1.Nantong Health Vocational School of Jiangsu Province，Nantong，Jiangsu，China 226010； 2.Qidong People′s Hospital，Nantong，Jiangsu，China 226200）

Objective To optimize the best extraction process forRadix Salviae miltiorrhizae and Ligusticum chuanxiong.Methods The tanshinoneⅡA，ferulic acid and dry extract yield were taken as the evaluation indexes of ethanol extraction process，the salvianolic acid B and dry extract yield were taken as the evaluation indexes of water extraction process，the optimum extraction process was screened by orthogonal test.Results The optimum extraction process of Radix Salviae Miltiorrhizae and Ligusticum Chuanxiong was adding 8 times amount of 80% alcohol，refluxing and extracting for 3 times，1.5 h each time.The residue was adding 8 times amount of water，refluxing and extracting for 3 times，1.5 h each time，then concentrating the water extraction to ρ ＝ 1.10(determined at 60 ℃ )，letting it at room temperature and adding 95% alcohol to 65% ，standing overnight，filtration，recycling ethanol to no alcohol flavor.Conclusion The optimized extraction process of Radix Salviae miltiorrhizae and Ligusticum chuanxiong by orthogonal test is stable and feasible，and the extraction rate of effective ingredients is high，which can provide experimental basis for industrial production.

Salvia miltiorrihiza； Ligusticun chuanxiong；tanshinoneⅡA；salvianolic acid B；phenolic acid；extraction process;orthogonal test

TQ460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)20－0029－05

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.008

施天慧（1980－），女，江蘇南通人，碩士研究生，講師，執業藥師，主要從事藥學專業教學工作，（電話）0513－51083102（電子信箱）55348482＠ qq.com。

2017－06－06)