普萘洛爾抗焦慮作用與腦內四氫孕酮相關性研究

丘秀玉，曾 潔，蔣 群，張玲玲

（廣州醫科大學附屬第五醫院，廣東 廣州 510700）

普萘洛爾抗焦慮作用與腦內四氫孕酮相關性研究

丘秀玉，曾 潔，蔣 群，張玲玲

（廣州醫科大學附屬第五醫院，廣東 廣州 510700）

目的探討普萘洛爾抗焦慮效應的作用機制。方法選用昆明小鼠50只，單次腹腔注射左旋－丁硫氨酸－亞砜亞胺（BSO）5 mg／kg建立焦慮癥動物模型，并按用藥的不同分為模型組（不額外用藥），普萘洛爾低劑量組（10 mg／kg）、中劑量組（20 mg／kg）、高劑量組（40 mg／kg）及舍曲林陽性藥組（10 mg／kg），各10只。另取10只小鼠作為正常對照組。各組小鼠給予相應劑量藥物，藥物質量濃度均為100 g／mL，正常對照組給予等體積的溶劑（生理鹽水），每天1次，連續灌胃7 d后開始抗焦慮藥效學評價。選用經典焦慮模型試驗（Vogel飲水沖突試驗、高架十字迷宮試驗和明暗箱穿梭試驗）評價普萘洛爾的抗焦慮作用；采用酶聯免疫吸附試驗測定法（ELISA）分別檢測小鼠前額皮質和海馬四氫孕酮的水平和血清皮質酮的濃度。行為學評價期間，每天給藥1 h后再進行試驗。結果Vogle飲水沖突試驗中，普萘洛爾連續給藥顯著性增加焦慮癥小鼠飲水次數；高架十字迷宮試驗中，普萘洛爾中、高劑量（20，40 mg／kg）顯著性增加焦慮癥小鼠在開臂的停留時間百分比和開臂次數百分比；明暗穿梭箱試驗中，普萘洛爾中、高劑量明顯增加焦慮癥小鼠明暗箱的穿梭次數及明箱的停留時間百分比；ELISA檢測結果顯示，與正常對照組比較，BSO注射小鼠海前額皮質和海馬的四氫孕酮含量顯著減少而血清皮質酮濃度明顯升高，普萘洛爾各劑量均能不同程度逆轉BSO引起的變化。結論普萘洛爾改善小鼠焦慮樣行為與腦內前額皮質和海馬的四氫孕酮有關，其可能通過升高前額皮質和海馬四氫孕酮的水平，進而抑制血清皮質酮的分泌。

普萘洛爾；抗焦慮；四氫孕酮；皮質酮；小鼠

焦慮癥是以發作性或持續性情緒焦慮和緊張為主要臨床表現的神經癥，發病機制至今尚未完全明確[1]。γ－氨基丁酸 （γ－amino－butylic acid，GABA）是中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質，可介導30%～40%神經元的傳導功能，在焦慮癥的發作中起重要作用[2]。GABAA受體的調控結合位點包括苯二氮 類藥物、神經類固醇、巴比妥類和印防己毒素5個結合位點[3]。作為GABAA受體調節劑的苯二氮 類抗焦慮藥物已臨床應用數十年。然而，由于GABAA受體苯二氮 結合位點分布較廣，影響機體多種生理功能，其激動劑盡管有明顯的抗焦慮作用，但也表現出鎮靜、肌肉松弛、運動不協調等不良反應，在一定程度上限制了該位點調節藥物的臨床前景[4]。因此，研究者開始將目光投向GABAA受體的其他結合點。近年來，以四氫孕酮為代表的神經類固醇激素逐漸成為挖掘抗焦慮藥物的關注點[5]。普萘洛爾為非選擇性β腎上腺素能受體阻滯劑，廣泛用于治療心血管疾病，新近研究提示其具有潛在的抗焦慮作用，尤其適用于對苯二氮 類藥物有成癮或耐受的患者[6]。然而，針對普萘洛爾治療焦慮癥的藥效作用機理研究一直處于空白。因此，本研究中擬采用小鼠焦慮癥模型，探討普萘洛爾發揮抗焦慮作用是否與四氫孕酮有關，為該藥防治焦慮癥提供實驗室依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試藥

動物：健康雄性成年昆明小鼠60只，SPF級，體質量（20±2）g，購自廣東省實驗動物中心，動物合格證號為SCXK（粵）2014－00114。所有小鼠正常飼養，自由飲水進食，飼養溫度24～26℃，相對濕度40% ～60%。

試藥：普萘洛爾（純度 ＞99%），舍曲林 （純度＞98%），左旋－丁硫氨酸－亞砜亞胺[L－bu－thionine－（S，R）－sulfoximine，BSO]，均為美國 Sigma－Aldrich 公司產品；水合氯醛（天津科密歐化學試劑有限公司）；四氫孕酮、皮質酮酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（上海生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

分組與給藥方法：將50只小鼠腹腔注射BSO（5 mg／kg）建立焦慮動物模型，并按用藥的不同分為模型組（不額外用藥），普萘洛爾低劑量組（10 mg ／kg）、中劑量組（20 mg ／kg）、高劑量組（40 mg ／kg）及舍曲林陽性藥組（10 mg／kg），各10只。另取10只小鼠作為正常對照組。各組小鼠給予相應劑量藥物，藥物質量濃度均為100 g／mL，正常對照組給予等體積的溶劑（生理鹽水），每天1次，連續灌胃7 d后開始抗焦慮藥效學評價。行為學評價期間，每天給藥1 h后再進行試驗。

Vogel飲水沖突試驗：小鼠禁水48 h后單獨放置于試驗箱，當小鼠在試驗箱內飲水20次后，控制儀自動開始計時3 min。當小鼠飲水20次，對其進行足底電擊1 次（0.30 mA，2 s），儀器自動記錄 3 min 內小鼠被電擊和主動飲水的次數。

高架十字迷宮試驗：將小鼠按頭朝開臂的方向置于十字迷宮中央，高架的高度不超過30 cm，觀察者與迷宮至少保持1 m的距離，攝像機記錄5 min內小鼠在開臂和閉臂內的停留時間和進入次數。分別以小鼠在開臂的停留時間、進入開臂的次數除以開閉臂停留總時間、進入開閉臂總次數計算百分率。

明暗箱穿梭試驗：小鼠置于明暗箱中自由活動5 min，然后將小鼠背對暗室置于明室中央觀察記錄10 min內小鼠在明暗箱的穿梭次數和明箱內停留時間，以此作為評價藥物抗焦慮作用的指標。整個試驗過程中注意保持實驗環境的安靜和實驗裝置的清潔，以減少外界環境對試驗結果的影響。

檢測方法：試驗結束后，于小鼠腹主動脈采血、離心收集血漿。另外快速分離腦組織，分別提取小鼠皮層、海馬蛋白進行ELISA檢測。組織按質量體積比1∶5加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）冰上超聲勻漿后，在4℃下以 12 000 r／min的速率離心 10 min，收集上清液。根據ELISA試劑盒步驟測定組織中四氫孕酮及血清皮質酮水平。

1.3 統計學處理

采用SPSS 18.0統計學軟件分析，各指標采用單因素方差分析，并采用 LSD－t分析方法進行組間兩兩比較，結果以均數±標準差表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Vogel飲水沖突試驗

與正常對照組比較，模型組小鼠飲水次數明顯減少，而普萘洛爾不同劑量小鼠的飲水次數呈劑量依賴性地增加，其中中、高劑量組（20，40 mg ／kg）的作用與模型組比較，差異有統計學意義（P ＜0.05，P ＜0.01）。詳見表1，提示普萘洛爾有一定的抗焦慮效應。

表1 Vogel飲水沖突試驗結果次，n＝10）

表1 Vogel飲水沖突試驗結果次，n＝10）

注：與正常對照組比較，＃P ＜0.01；與模型組比較， P ＜0.05，P ＜0.01。表 2，表 4 同。

組別正常對照組模型組舍曲林組 （5 mg ／kg）普萘洛爾 低劑量組 （10 mg／kg）中劑量組 （20 mg ／kg）高劑量組 （40 mg ／kg）飲水次數93.51 ± 5.27 64.23 ± 2.96＃92.92 ± 4.08 72.44 ± 3.45 82.92 ± 4.11 90.28 ± 2.96

2.2 高架十字迷宮試驗

普萘洛爾在不影響入臂總次數和總時間（P＞0.05）的前提下，可較模型組顯著增加小鼠開臂停留時間百分率（20 mg／kg，P ＜0.05；40 mg／kg，P ＜0.01） 和進入開臂次數的百分率（20 mg／kg，P ＜0.05；40 mg／kg，P ＜0.01）。詳見表2。進一步表明，普萘洛爾有明顯的抗焦慮作用。

2.3 明暗箱穿梭試驗

與正常對照組相比，模型組小鼠在明暗箱中穿梭次數及在明箱內停留時間比減少（P＜0.01），經普萘洛爾給藥后，兩指標數據均有所增加，其中中劑量組、高劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。詳見表3。表明普萘洛爾不僅有抗焦慮效應，且藥效有一定的劑量依賴性。

表2 高架十字迷宮試驗結果%，n＝10）

表2 高架十字迷宮試驗結果%，n＝10）

組別正常對照組模型組舍曲林組 （5 mg ／kg）普萘洛爾 低劑量組 （10 mg／kg）中劑量組 （20 mg ／kg）高劑量組 （40 mg ／kg）開臂次數27.39 ± 4.01 13.96 ± 2.96＃26.26 ± 3.56 16.20 ± 1.75 24.06 ± 3.27 27.70 ± 5.62開臂停留時間比21.33 ± 2.64 9.32 ± 1.47＃19.33 ± 1.36 13.37 ± 1.48 17.34 ± 2.44 20.19 ± 2.53

表3 明暗箱穿梭試驗結果（n＝10）

表3 明暗箱穿梭試驗結果（n＝10）

注：與正常對照組比較，＃P ＜0.01；與模型組比較， P ＜0.01。表5同。

組別正常對照組模型組舍曲林組 （5 mg ／kg）普萘洛爾 低劑量組（10 mg／kg）中劑量組 （20 mg ／kg）高劑量組 （40 mg ／kg）穿梭次數（次）41.50 ± 5.27 18.20 ± 2.96＃39.90 ± 4.08 20.40 ± 3.45 27.90 ± 4.11 37.20 ± 2.96明箱停留時間比（%）34.70 ± 3.86 20.20 ± 4.32＃30.10 ± 3.12 24.70 ± 3.34 26.00 ± 3.52 29.10 ± 3.28

2.4 對小鼠前額皮質和海馬腦區四氫孕酮水平的影響

與正常對照組比較，模型組前額皮質及海馬腦區的四氫孕酮含量出現顯著減少（P＜0.01），普萘洛爾和陽性對照藥舍曲林均能明顯增加小鼠前額皮質和海馬腦區四氫孕酮水平，其中普萘洛爾中、高劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（20 mg／kg，P ＜ 0.05；40 mg／kg，P ＜0.01）。詳見表 4（為方便起見，每組僅任選6只小鼠進行檢測。表5同）。表明普萘洛爾發揮抗焦慮作用可能與增加大腦前額皮質和海馬四氫孕酮水平有關。

表4 普萘洛爾對小鼠前額皮質和海馬腦區四氫孕酮水平的影響（，pg／mL，n＝6）

表4 普萘洛爾對小鼠前額皮質和海馬腦區四氫孕酮水平的影響（，pg／mL，n＝6）

組別 四氫孕酮正常對照組模型組舍曲林組 （5 mg ／kg）普萘洛爾 低劑量組（10 mg／kg）中劑量組（20 mg ／kg）高劑量組（40 mg ／kg）前額皮質273.22 ± 7.48 178.26 ± 9.80＃220.51 ± 8.53 184.82 ± 9.51 195.82 ± 9.31 210.91 ± 8.32海馬332.27 ± 11.60 128.91 ± 19.88＃289.32 ± 11.23 133.46 ± 15.46 168.05 ± 13.73 220.31 ± 12.69

2.5 對小鼠血漿中皮質酮水平的影響

與正常對照組相比，模型組血清皮質酮的水平明顯增高，各劑量普萘洛爾和陽性藥舍曲林均明顯降低小鼠血漿中皮質酮水平，其中普萘洛爾中、高劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。詳見表5。提示普萘洛爾可能對應激引起的皮質酮水平增高有調節作用。

表5 普萘洛爾對小鼠血漿中皮質酮水平的影響（，pmol／L，n＝6）

表5 普萘洛爾對小鼠血漿中皮質酮水平的影響（，pmol／L，n＝6）

組別正常對照組模型組舍曲林組（5 mg ／kg）普萘洛爾 低劑量組（10 mg／kg）中劑量組（20 mg ／kg）高劑量組（40 mg ／kg）血清皮質酮80.81 ± 10.72 129.25 ± 9.16＃82.32 ± 8.83 119.10 ± 13.80 99.39 ± 9.75 854.30 ± 10.72

3 討論

焦慮是神經官能癥的常見癥狀，以往多以苯二氮類藥物治療。由于該類藥物不良反應較多，尋求安全性高的有效替代藥物一直是臨床迫切的需求。應激反應引起的焦慮往往伴有交感神經系統的激活，而交感神經的激活反應則受到β腎上腺素受體的調節[7]。β－受體阻滯劑能減輕或降低應激性心動過速、心律失常和血漿脂肪酸的升高，對社交場合所產生的緊張和主觀焦慮不適均有一定的緩解作用。然而針對該類藥（如普萘洛爾）的基礎性研究并不多，其如何發揮焦慮效應的機理也不明確。因此，本研究中采用BSO注射建立小鼠焦慮模型，對普萘洛爾進行藥效學基礎評價并觀察其對四氫孕酮及皮質酮的作用，結果證實，普萘洛爾改善小鼠的焦慮樣行為可能與調節腦內四氫孕酮和血漿皮質酮水平有關。

本研究中采用的焦慮評價方法中，Vogel飲水沖突試驗是基于條件反射原理構建的，將飲水和不確定電擊關聯，讓小鼠在飲水和避免電擊沖突之間做出選擇，以評價小鼠的焦慮樣癥狀[8]；高架十字迷宮則是屬于非條件反射模型，以小鼠自發恐懼反應為行為基礎，讓小鼠暴露于開放性和封閉性場合，以觀察小鼠的焦慮樣行為[9]；明暗箱穿梭試驗是以明箱中的亮光作為刺激源，由于小鼠本身趨暗的習性，當其被置于明箱中則會表現出焦慮樣癥狀，故其在明暗箱中穿梭次數及明箱停留時間被作為評價抗焦慮的重要指標[10]。以上3個模型均為國際公認的評價焦慮反應的方法，被廣泛應用于大、小鼠等嚙齒類動物。本研究結果表明，普萘洛爾能增加小鼠的飲水次數、在開臂停留的時間和次數以及明暗箱穿梭次數、明箱停留時間百分比，具備明確的抗焦慮藥理效應。

研究表明，在小鼠明暗箱穿梭和高架十字迷宮焦慮模型試驗中，神經類固醇激素具有明確的抗焦慮行為學作用，而四氫孕酮發揮著決定性作用；將四氫孕酮直接注入大腦相關腦區，小鼠進入開臂次數和時間百分比明顯增多。與苯二氮 類藥物相比，四氫孕酮發揮抗焦慮效應，并不影響小鼠的自主活動，有可能是神經類固醇激素治療焦慮癥疾病的潛在關注點[11]。應激主要與下丘腦－垂體－腎上腺（HPA）軸有關，焦慮會導致血漿皮質酮水平迅速升高，進而引起機體的各種損傷。四氫孕酮具有負性調節HPA軸的作用，可通過一系列的下游信號轉導通路影響皮質酮的水平[12]。本研究結果也證實，普萘洛爾對能增加腦內四氫孕酮的水平，進而降低血漿皮質酮的水平而產生抗焦慮作用。盡管如此，普萘洛爾介導的四氫孕酮水平升高如何影響皮質酮還有待進一步闡明。

綜上所述，普萘洛爾作為心血管疾病治療的一線藥物，其抗焦慮藥理作用明確，可作為替代藥物，用于對苯二氮 類藥物有高度依賴危險性患者，且毒性小，安全性較高，值得臨床推廣。

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Correlation Study Between Anxiolytic Effect of Propranolol and Allopregnanolone in Brain

Qiu Xiuyu，Zeng Jie，Jiang Qun，Zhang Lingling
（The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong，China 510700）

Objective To investigate the mechanism of anxiolytic effect of propranolol.Methods Totally 50 Kunming mice were given single intraperitoneal injection of 5 mg ／kg BSO for establishing anxiety animal models，and they were divided into model group （no additional medication），propranolol low－ dose group （10 mg ／kg），medium dose group （20 mg ／kg），high dose group （40 mg ／kg） and sertraline positive drug group （10 mg ／kg），10 cases in each group.Another 10 mice were selected as normal control group.Each group of mice was given the corresponding dose of medicine，the normal control group was given equal volume of solvent （physiological saline），1 time a day，after continuous intragastric administration of 7 d，the anti anxiety pharmacodynamics was evaluated.The anxiolytic effects of propranolol were evaluated by the classic anxiety model test （Vogel′s conflict test，elevated plus maze test and light－ dark box test）.The level of allopregnanolone and concentration of serum corticosterone in the prefrontal cortex and hippocampus of mice were detected by ELISA.During the behavioral evaluation，the test was done after the medication of 1 h every day.Results Vogel′s conflict test showed that continuous administration of propranolol could significantly increase the number of drinking water in anxiety mice.Elevated plus maze test showed that the median and high doses of propranolol （20，40 mg ／kg） significantly increased the anxiety mice′s percentage of residence time and the number of open arm entering.In light－ dark box test，median and high dose of propranolol significantly increased the anxiety mice′s percentage of residence time in the light box and the shuttle number in light－ dark box.In the ELISA test，compared with the normal control group，the level of allopregnanolone in the prefrontal cortex and hippocampus of mice injected with BSO were significantly decreased，while the concentration of serum corticosterone was significantly increased.Each dose of propranolol can reverse the change induced by BSO in different degrees.Conclusion The effect of propranolol on anxiety－ like behavior in mice is related to allopregnanolone in the prefrontal cortex and hippocampus of the brain，which may increase the level of allopregnanolone in prefrontal cortex and hippocampus and then inhibit the secretion of corticosterone in serum.

propranolol；antianxiety；allopregnanolone；corticosterone；mice

R965.2；R971

A

1006－4931(2017)20－0034－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.009

丘秀玉（1984 － ），女，大學本科，研究方向為精神藥理學，（電話）020 － 82288145（電子信箱）437496216＠ qq.com。

2017－06－06)