高效液相色譜法同時測定防風(fēng)中4種主要成分含量

楊曉琴，任紅燕

（新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 喀什 844000）

高效液相色譜法同時測定防風(fēng)中4種主要成分含量

楊曉琴，任紅燕

（新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 喀什 844000）

目的探討防風(fēng)藥材的質(zhì)量控制方法。方法改進(jìn)高效液相色譜（HPLC）法的色譜條件。色譜柱為迪馬Dikma鉆石二代C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 m），流動相為甲醇 －水，梯度洗脫，流速為 1.0 mL／min，檢測波長為 254 nm，柱溫為 25℃，進(jìn)樣量為 2～10 L。結(jié)果防風(fēng)藥材中防風(fēng)色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅰ、防風(fēng)色原酮Ⅲ葡萄糖苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度線性范圍分別為 0.077 ～ 0.698 g／L，0.039 6 ～ 0.356 g／L，0.029 2 ～ 0.263 g／L，0.018 ～0.162 g／L，平均加樣回收率分別為 99.23% ，99.62% ，97.26% ，102.20% ，RSD 分別為 1.90% ，1.67% ，1.40% ，1.36% （n ＝5）。結(jié)論改進(jìn)后的 HPLC 法方法簡便，精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度均良好，可同時測定防風(fēng)藥材中多種成分的含量。

高效液相色譜法；防風(fēng)；色原酮類成分；含量測定

防風(fēng)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，屬多年生草本植物，主產(chǎn)于我國東北、華北等地區(qū)。藥用防風(fēng)為傘形科植物Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk 未抽花莖的干燥根，具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、免疫、抗癲癇等藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛[1]。防風(fēng)的功效發(fā)揮與成分含量相關(guān)，目前已鑒定其含有色原酮、香豆素、多糖類及揮發(fā)性成分等100多種化學(xué)成分，但多為小分子化合物。為確定藥效與基礎(chǔ)化學(xué)成分的關(guān)系，需開展基礎(chǔ)化學(xué)成分的定量分析研究[2]。高效液相色譜（HPLC）法因操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于中藥材的化學(xué)成分檢測中[3]。本研究中擬改進(jìn)《中國藥典》中HPLC法的色譜條件，以同時測定防風(fēng)藥材的4種化學(xué)成分，并比較方法改進(jìn)前后樣品含量檢測結(jié)果。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

iChrom 5100型高效液相色譜儀（流量范圍～10.000 mL ／min，流量準(zhǔn)確度不超過 ± 0.2% ，大連依利特分析儀器有限公司）；BK－FD10S型冷凍干燥機(jī)（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；Ohaus AX223ZH／E型電子分析天平（量程220 g，可讀性1 mg，美國奧豪斯儀器有限公司）；Chencent－10LH型超聲波清洗器（輸出功率180 W，頻率40 kHz，容量6 L，上海臣迅儀器科技有限公司）。

1.2 試藥

防風(fēng)藥材購自亳州市龍輝藥業(yè)銷售有限公司，產(chǎn)地包括齊齊哈爾、內(nèi)蒙古、亳州，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所謝宗萬教授鑒定為傘形科植物 Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk未抽花莖的干燥根；防風(fēng)色原酮Ⅰ葡萄糖苷對照品、防風(fēng)色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅰ、防風(fēng)色原酮Ⅲ葡萄糖苷對照品，均由本實(shí)驗(yàn)室從藥材中分離鑒定，純度＞98%；甲醇（美國費(fèi)希爾Fisher公司）為色譜純；娃哈哈純凈水（杭州哇哈哈集團(tuán)公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：迪馬 Dikma鉆石二代 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 水，梯度洗脫（見表 1）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：2 ～ 10 μL。分別量取對照品溶液 3 μL、供試品溶液2 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。在此色譜條件下，各檢測組分色譜峰分離良好，理論板數(shù)均大于3 000，色譜圖見圖 1。

表1 流動相梯度洗脫條件

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取防風(fēng)色原酮Ⅰ葡萄糖苷對照品、防風(fēng)色原酮Ⅱ葡萄糖苷對照品、防風(fēng)色原酮Ⅰ對照品、防風(fēng)色原酮Ⅲ葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成防風(fēng)色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅰ、防風(fēng)色原酮Ⅲ葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為 0.388，0.396，0.292，0.270 g／L的對照品貯備液。

供試品溶液：稱取防風(fēng)藥材適量，精密稱定，加適量稀甲醇回流提取，提取液回收溶劑，殘留物加水分散，通過大孔吸附樹脂柱，樹脂柱水洗除雜后，用稀乙醇洗脫；乙醇洗脫液回收溶劑，殘留物減壓干燥，得防風(fēng)色原酮部位。稱取防風(fēng)色原酮部位約10 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加50%乙醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，備用[4]。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：量取各對照品貯備液適量，置10 mL容量瓶中，加提取溶劑配制成對照品溶液，防風(fēng)色原酮Ⅰ葡萄糖苷對照品溶液進(jìn)樣 2，4，6，8，10，12 μL，其他3 種對照品溶液進(jìn)樣 1，3，5，7，9，11 μL，按擬訂色譜條件測定，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取各對照品溶液4 μL，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，依法測定。結(jié)果防風(fēng)色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅰ、防風(fēng)色原酮Ⅲ葡萄糖苷峰面積值的 RSD分別為0.98% ，1.31% ，2.01% ，2.11% （n ＝ 5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一防風(fēng)藥材5份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果防風(fēng)色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅰ、防風(fēng)色原酮Ⅲ葡萄糖苷峰面積值的 RSD分別為2.21% ，1.42% ，2.43% ，2.24% （n ＝ 5），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，于配置后 0，2，4，6，8，10 h 時分別進(jìn)樣 4 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果防風(fēng)色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅰ、防風(fēng)色原酮Ⅲ葡萄糖苷峰面積值的 RSD 分別為 0.98% ，0.74% ，0.35% ，1.68%（n＝6），均低于 2%，表明供試品溶液在 10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的樣品0.25 g，精密稱定，加入4種對照品適量，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測定含量，計算回收率。結(jié)果見表3。

2.4 樣品含量測定

稱取來自不同地區(qū)的防風(fēng)藥材各 0.5 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按本研究中擬訂的方法（新方法）進(jìn)樣測定含量。同時，采用藥典法（舊方法）進(jìn)樣測定，并比較新舊方法的測定結(jié)果。結(jié)果見表4。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

3 討論

分析藥物所含成分，有助于判斷藥物應(yīng)用過程的治療機(jī)制。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)藥材中含有防風(fēng)色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅰ、防風(fēng)色原酮Ⅲ葡萄糖苷等，在治療疾病中具有較好的效果[5－7]。其憑借自身止痛止瀉、活血化瘀以及祛風(fēng)解表等功效，被臨床廣泛地應(yīng)用[8－9]。隨著目前中藥臨床治療地位的提升，國內(nèi)外也掀起了防風(fēng)中藥臨床藥理的研究，進(jìn)一步擴(kuò)大了防風(fēng)的市場需求量，開發(fā)前景相對廣闊。為了保證防風(fēng)藥材的市場地位，加強(qiáng)含防風(fēng)藥品成分、品質(zhì)的檢測尤為重要。近年來對防風(fēng)質(zhì)量控制的研究方法也逐漸多樣化，定性鑒別包括性狀、顯微鑒別等方式，定量分析方法包括薄層掃描、HPLC法、紫外分光光度法、膠束和高效毛細(xì)管電泳法等[10－12]。中藥材的質(zhì)量控制一般采用色譜指紋圖譜技術(shù)，而對于中藥材成分含量的檢測，多采用HPLC－DAD法。為測定防風(fēng)藥材中主要成分的含量，本研究中選取了HPLC法。

表4 新舊方法樣品含量測定結(jié)果比較（%）

防風(fēng)含有多種化學(xué)成分，包括色原酮、有機(jī)酸、雜多糖、聚乙炔等，直接采用流動相梯度洗脫進(jìn)行含量測定，結(jié)果容易產(chǎn)生較大差異，且干擾因素較多[13]。對此，本研究中在試驗(yàn)前均進(jìn)行了系統(tǒng)的預(yù)處理。本研究中采用的提取溶劑為甲醇（熔點(diǎn)－97.8℃，沸點(diǎn) 64.5℃），自身干擾性小，且提取效果理想，可保證較高的提取率。而乙醇雖然價格便宜、無毒，多適用于生產(chǎn)操作的應(yīng)用。一般分析測試少量提取均采用甲醇，因?yàn)榧状嫉奶崛÷适且掖疾荒鼙葦M的。同時為保證最佳檢測效果，利用正交提取工藝，明確了最佳提取方案，即超過防風(fēng)樣本量30 倍的提取溶劑（甲醇），提取 2 次，頻率 2 h ／次[14－16]。通過樣品處理，保證了檢測結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性，為成分測定打下基礎(chǔ)。

本研究中選取的分析指標(biāo)，主要為防風(fēng)色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防風(fēng)色原酮Ⅰ、防風(fēng)色原酮Ⅲ葡萄糖苷4種成分，通過甲醇回流提取、液相色譜分離，在固定檢測波長（254 nm）處測定，采用外標(biāo)法對其含量進(jìn)行計算，滿足了試驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)性、準(zhǔn)確性等要求。由表4可見，新舊方法檢測結(jié)果基本一致，同時新方法在操作簡易性，測定結(jié)果綜合穩(wěn)定性、經(jīng)濟(jì)性、精準(zhǔn)度等方面也有明顯提高。

綜上所述，采用本研究中改進(jìn)的HPLC法，可快速測定防風(fēng)藥材的4種主要成分含量，同時該方法精確性、高效率等也有優(yōu)勢，可為防風(fēng)藥材的質(zhì)量控制提供參考。

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Content Determination of Four Main Components in Saposhnikovia Divaricata by HPLC

Yang Xiaoqin，Ren Hongyan
（Institute of Food and Drug Administration of Kashi in Xinjiang Uygur Autonomous Region，Kashi，Xinjiang，China 844000）

Objective To investigate the method of quality control of Saposhnikovia divaricata.Methods The chromatographic conditionsof HPLC were improved.The chromatographic column was Dikma diamonsil Ⅱ C18column （150 mm × 4.6 mm，5 μm），the mobile phase consisted of methanol － water，gradient elution，the flow rate was 1.0 mL ／min，the detection wavelength was 254 nm，the column temperature was 25 ℃，the sample size was 2 － 10 μL.Results The linear range of prim －O －glucosylcimifugin，4′－O －β －D －glucosyl－ 5 － O － methylvisamminol，cimifugin，sec － o － glucosylhamaudol were 0.077 － 0.698 g ／L，0.039 6 － 0.356 g／L，0.029 2 － 0.263 g／L and 0.018 － 0.162 g ／L，respectively.The average recoveries were 99.23% ，99.62% ，97.26% ，102.20% ，respectively，and RSDs were 1.90% ，1.67% ，1.40% ，1.36% （n ＝ 5）.Conclusion The improved HPLC method is simple and has good precision，repeatability and accuracy，which can simultaneously determine the content of various components in Saposhnikovia divaricata.

HPLC； Saposhnikovia divaricata；chromone ketone；content determination

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2017)20－0037－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.010

楊曉琴（1982－），女，漢族，甘肅武威人，大學(xué)本科，主管藥師，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)分析，（電子信箱）13797510＠qq.com。

2017－06－06；

2017－07－20)