金寶腎片質(zhì)量標準研究

王曙東，錢文慧，廖 欣，易 偉，蘇 華

（中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京 210002）

金寶腎片質(zhì)量標準研究

王曙東，錢文慧，廖 欣，易 偉，蘇 華

（中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京 210002）

目的建立金寶腎片的質(zhì)量標準。方法采用薄層色譜（TLC）法對金寶腎片中的大黃素進行定性鑒別，并采用高效液相色譜法測定金寶腎片中卡托普利及大黃酸、大黃素、大黃酚的含量，并進行方法學(xué)驗證。結(jié)果大黃素的薄層色譜斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾?？ㄍ衅绽|(zhì)量濃度在 18．964 ～94．820 g／mL（R2＝0．999 8）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為 96．97% （n ＝9）；大黃酸、大黃素、大黃酚檢測質(zhì)量濃度分別在 2．19 ～17．52 g／mL（R2＝ 0．999 9），1．47 ～ 11．76 g／mL （R2＝0．999 9），6．97 ～55．76 g ／mL（R2＝ 0．999 9）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為 102．91% ，103．03% ，102．06% （n ＝9）。結(jié)論該質(zhì)量標準方法可行，專屬性強，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

金寶腎片；卡托普利；大黃酸；大黃素；大黃酚；質(zhì)量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法

金寶腎片為我院與解放軍腎臟病研究所共同研制的院內(nèi)制劑，其主要有效成分為卡托普利及大黃提取物，有升清消濁、調(diào)節(jié)代謝、保護腎功能、降低血壓、糾正脂質(zhì)代謝紊亂的功效，主要用于治療各種原因引起的慢性腎功能衰竭癥，尤其能改善高血壓、心力衰竭等并發(fā)癥，臨床療效較好?？ㄍ衅绽麨榻?jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI），降壓療效確切[1]。大黃提取物包括大黃酸、大黃素、大黃酚等，近年來因其良好的抗菌、消炎、抗氧化、調(diào)節(jié)糖代謝的藥理活性而被臨床廣泛用于各種腎炎、糖尿病腎病、慢性腎功能不全的治療[2－4]。為了有效控制該制劑的質(zhì)量，保障藥品安全有效，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對金寶腎片中的大黃素進行定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對金寶腎片中的有效成分卡托普利及大黃酸、大黃素、大黃酚的測定方法進行研究?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司；KQ－250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；FA1604S型電子天平（上海天平儀器廠）；AE240型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）。

1．2 試藥

卡托普利對照品（批號為100318－200602，含量為99．5% ），大黃素對照品（批號為 110756 － 200206，含量為 100．0%），大黃酸對照品（批號為 110757－200110，含量為 100．0%），大黃酚對照品（批號為 110796－201319，含量為99．5%），均購于中國食品藥品檢定研究院；薄層層析硅膠G（青島海洋化工廠）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；金寶腎片（醫(yī)院自制制劑，批號分別為 140730，140818，141017，規(guī)格為每片 0．25 g）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 大黃素鑒別(TLC法)

取本品10片，除去薄膜衣，研細，稱取2 g，精密稱定，加20%硫酸20 mL，二氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，放冷，用棉花過濾至分液漏斗中，分取二氯甲烷層，另置；水層再加二氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃素對照品，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的對照品溶液。按處方比例稱取除大黃外的其余輔料及卡托普利，研細，按本品制備工藝及供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB薄層色譜法試驗，吸取上述3種溶液各20 μL，精密量取，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯 －甲酸（15∶5∶1）上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的黃色斑點；氨蒸氣熏后，斑點變?yōu)榧t色，同時陰性對照無此斑點，表明處方中其他輔料及卡托普利對大黃的鑒別無干擾，色譜圖見圖 1。共取 3批（批號分別為 140730，140818，140909）樣品，進行驗證試驗，該方法鑒別結(jié)果均呈正反應(yīng)，表明該方法準確可行。

圖1 薄層色譜圖

2．2 檢查

3批樣品均符合2010年版《中國藥典（一部）》附錄Ⅰ“片劑”項下有關(guān)檢查的各項規(guī)定。2．3 卡托普利含量測定(HPLC法)2．3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Lichrospher C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－0．1%磷酸溶液－四氫呋喃（30∶70∶0．15)；檢測波長：215 nm；柱溫：40 ℃；流速：1 mL ／min；進樣量：20 μL。理論板數(shù)按卡托普利峰計算應(yīng)不得低于20 000。

2．3．2 溶液制備

取卡托普利對照品適量，稱取50 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成卡托普利對照品貯備液（質(zhì)量濃度為 0．474 1 g／L）；精密量取對照品貯備液3 mL，置25 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取本品適量，除去薄膜衣，用研缽研細，稱取0．25 g，精密稱定，置平底燒瓶中，加流動相100 mL，稱定質(zhì)量，50℃加熱回流2 h，放冷，用流動相補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按處方比例和樣品制備工藝制成不含卡托普利的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2．3．3 測定法

精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法計算峰面積，即得。本品含卡托普利應(yīng)為標示量的85．0% ～115．0%。

2．3．4 方法學(xué)考察

專屬性試驗：精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照品溶液各20 μL，按擬訂方法進行測定，記錄色譜圖。由圖2可見，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)保留時間處，均有與對照品溶液色譜相對應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，而陰性對照品溶液則無相應(yīng)峰出現(xiàn)，表明陰性對照無干擾。

線性關(guān)系考察：分別精密量取對照品貯備液1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 mL，置 25 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，依法進行測定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝22 296 X－7．13，R2＝0．999 8（n＝5）。結(jié)果表明，卡托普利質(zhì)量濃度在 0．018 964～0．094 820 g／L 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品貯備液20 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣5次。結(jié)果卡托普利峰面積的RSD為0．83%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為130818）樣品，依法制備供試品溶液，進樣測定，在常溫下分別于0，1，2，4，8 h時進樣，記錄卡托普利峰面積。結(jié)果的 RSD為1．10%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為130818）樣品5份，依法制備供試品溶液，進樣測定。結(jié)果的 RSD為0．51%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

圖2 卡托普利含量測定高效液相色譜圖

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為140818），精密稱取 0．012 5 g，共 9 份，分別置平底燒瓶中，按低、中、高3個質(zhì)量濃度分別精密加入對照品貯備液3，5，7 mL，依法制備供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

2．3．5 樣品含量測定

取 3 批（批號分別為 140730，140818，140909）樣品，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下測定含量。結(jié)果3 批樣品中卡托普利含量分別為 4．86，4．82，4．93 mg。2．4 大黃酸、大黃素、大黃酚含量測定(HPLC法)2．4．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Lichrospher C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －0．1% 磷酸溶液（70 ∶30）；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL ／min；進樣量：20 μL。理論板數(shù)分別按大黃酸峰、大黃素峰、大黃酚峰計算應(yīng)不得低于20 000。

2．4．2 溶液制備

精密稱取大黃酸、大黃素、大黃酚對照品適量，置200 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含大黃 酸 21．90 μg ／mL、 大 黃 素 14．70 μg ／mL、 大 黃 酚6．97 μg／mL的對照品混合貯備液；精密吸取對照品貯備液4 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。取[裝量差異]項下的本品適量，用研缽研細，精密稱取0．15 g置平底燒瓶中，加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按照該藥的處方稱取不含大黃提取物的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。

表1 卡托普利加樣回收試驗結(jié)果(n＝9)

2．4．3 測定法

精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法計算峰面積，即得。本品每粒含大黃酸、大黃素、大黃酚總量不得低于3．0 mg。

2．4．4 方法學(xué)考察

專屬性試驗：精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照品溶液各20 μL，按擬訂色譜條件進行測定，記錄色譜圖。由圖3可見，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)保留時間處有相同色譜峰，而陰性對照品溶液則無相應(yīng)峰出現(xiàn)，表明陰性對照品無干擾。

圖3 大黃類成分含量測定高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密吸取混合對照品貯備液1．0，2．0，4．0，6．0，8．0 mL，置 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，依法進行測定，以對照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 大黃酸、大黃素、大黃酚線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液20 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣5次。結(jié)果大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積的 RSD 分別為 0．51%，0．40%，0．46%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為140818）樣品，依法制備供試品溶液并進行測定，在常溫下分別于0，1，2，4，8 h時進樣測定。結(jié)果大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積的 RSD 分別為 1．29% ，0．13%，0．05% （n ＝ 5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為140818）樣品5份，依法制備供試品溶液并進行測定。結(jié)果大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積的 RSD 分別為 0．59% ，0．61% ，1．05%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的金寶腎片樣品（批號為 140818）0．075 g，共 9 份，分別置平底燒瓶中，按低、中、高3個質(zhì)量濃度分別精密加入混合對照品貯備液6，10，15 mL，依法制備供試品溶液。精密吸取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，測定含量，計算回收率。結(jié)果見表3。

2．4．5 樣品含量測定

取 3 批（批號分別為 140730，140818，140909）金寶腎片，依法制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果見表4。綜合3批樣品測定結(jié)果，確定本品含卡托普利應(yīng)為標示量的85% ～115%，每片含大黃酸、大黃素、大黃酚總量不得低于 3．0 mg。

表3 大黃酸、大黃素、大黃酚加樣回收試驗結(jié)果(n＝9)

表4 樣品中大黃酸、大黃素、大黃酚含量測定結(jié)果（mg）

3 討論

3．1 有效成分選擇

金保腎片的處方主要為卡托普利及大黃提取物。大黃提取物中大黃酸、大黃素、大黃酚因具有良好的抗菌、消炎、抗氧化、調(diào)節(jié)糖代謝的藥理活性而被廣泛用于各種腎炎及腎病的治療[5－8]。大黃提取物中蘆薈大黃素和大黃素甲醚的藥效則與腎病的治療相關(guān)性不是很大，其中蘆薈大黃素的功效則側(cè)重于心血管保護，保肝，抗腫瘤及瀉下，大黃素甲醚則側(cè)重于抗缺血、抗缺氧腦損傷等神經(jīng)保護作用。因此，在制訂金保腎片質(zhì)量標準時，選擇與腎病治療相關(guān)性較大的卡托普利及大黃酸、大黃素、大黃酚作為質(zhì)控指標?？ㄍ衅绽麨榧讕€丙脯酸，呈弱酸性，且對光、熱不穩(wěn)定；大黃酸、大黃素、大黃酚屬于蒽醌類衍生物，結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，呈弱酸性，但大黃酸、大黃素、大黃酚的極性比卡托普利更強。鑒于兩類成分的性質(zhì)差異，尤其是卡托普利的不穩(wěn)定性，需分開檢測。本研究中分別建立了金寶腎片中兩類有效成分的含量測定方法。

3．2 檢測波長選擇

分別測定了金寶腎片中兩類成分的最大吸收波長。檢測發(fā)現(xiàn)，卡托普利最大吸收為末端吸收，參考2010年版《中國藥典》及文獻[9－11]，選取吸光度合適的215 nm為檢測波長；分別對大黃酸、大黃素、大黃酚在200～400 nm波長內(nèi)進行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)3個成分的最大吸收均為末端吸收，最終選擇大黃酸、大黃素、大黃酚對照品吸光度較大的254 nm為檢測波長。

3．3 流動相選擇

根據(jù)兩類有效成分化學(xué)性質(zhì)的差異分別進行了流動相考察。根據(jù)卡托普利的酸性，發(fā)現(xiàn)流動相pH為2．6～2．8時，樣品較穩(wěn)定。因此，試用了不同類別的流動相，發(fā)現(xiàn)0．01 mol／L磷酸二氫鈉－甲醇－乙腈（70∶25∶5）樣品峰形不佳，且分離度不好；甲醇－0．1%磷酸溶液（70∶30）出峰時間和分離度均不好；甲醇 －0．1%磷酸 －四氫呋喃（28∶72∶0．15），樣品峰形及分離度均較好。故選擇其為卡托普利的最佳流動相。首先根據(jù)前期研究的基礎(chǔ)，選擇甲醇 －0．2%磷酸溶液（75∶25）為流動相，發(fā)現(xiàn)大黃酸、大黃素、大黃酚的出峰時間及分離度較好，但大黃酚的峰形拖尾；后采用甲醇－0．5%醋酸（75 ∶25）及甲醇 － 0．5%醋酸（70 ∶30）流動相體系，發(fā)現(xiàn)大黃酚峰形拖尾未改善，同時大黃酸也出現(xiàn)拖尾；進一步選擇甲醇 －0．1%磷酸溶液（70∶30）體系，大黃酸、大黃酚峰形均較好。因此，采用甲醇－0．1%磷酸溶液（70 ∶30）為流動相。

3．4 提取方法及條件選擇

金寶腎片中卡托普利的提取方法，參考藥典及文獻[12]進行了提取方法考察，發(fā)現(xiàn)由于卡托普利對熱不穩(wěn)定，因此回流的提取方式比超聲更穩(wěn)定，同時回流的溫度不能過高，50℃提取2 h效率最高。大黃有效成分的提取方法參考文獻[13－14]，發(fā)現(xiàn)采用補足減重法在60℃回流提取大黃酸、大黃素、大黃酚2 h的提取效率較高，操作簡便，重復(fù)性較好。

[1]劉曉燕，蘇 暢．RP－HPLC測定卡托普利緩釋膠囊含量[J]．基層醫(yī)學(xué)論壇，2009，13(10):877 －878．

[2]杜 宏，邵家慶，顧 萍，等．大黃酸治療對db／db小鼠第一相胰島素分泌的影響[J]．中國中藥雜志，2010，35(20):2764－2767．

[3]黃燕飛，劉志紅，陳慧萍，等．大黃酸和羅格列酮對db／db糖尿病小鼠代謝紊亂和腎臟損傷的作用比較[J]．腎臟病與透析腎移植雜志，2004，13(3):215．

[4]Yang ZC，Wang BC，Yang XS，et al．The synergistic activity of antibiotics combined with eight traditional Chinese medicines against two different strains of staphylococcus aureus[J]．Colloida Surf B Biointerfaces，2005，41(2 － 3):79．

[5]董 培．卡托普利緩釋片采用HPLC法含量測定結(jié)果分析[J]．中國醫(yī)藥科學(xué)，2011，1(10)：104．

[6]鄭夢薇，許曉峰．卡托普利片含量測定方法的研究[J]．中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，7(2)：7 － 10．

[7]朱 偉，王學(xué)美．大黃治療慢性腎功能衰竭機制的研究進展[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25(5)：471 －475．

[8]孫 華，潘行山，謝海棠．大黃治療慢性腎功能衰竭的系統(tǒng)評價[J]．中國醫(yī)藥指南，2012，10(23)：614 －615．

[9]何英梅，歐陽曉玫．卡托普利片質(zhì)量標準的改進[J]．藥物分析雜志，2007，27(1):135 －138．

[10]田雁英 ．HPLC法測定卡托普利片含量[J]．中國藥事，2008，22(5):409 － 410．

[11]王志平，李保軍．高效液相色譜法測定測定橘紅丸中苦杏仁苷的含量[J]．中南藥學(xué)，2013，11(3):225 －227．

[12]王 璐．高效液相色譜法測定復(fù)方卡托普利尼群地平膠囊中卡托普利的含量[J]．海峽藥學(xué)，2012，24(10):85－86．

[13]于永州．HPLC法測定通便寧片中蘆薈大黃素和大黃酸的含量[J]．世界中醫(yī)藥，2010，5(5):368－369．

[14]安富榮，石燕紅，崔 嵐，等．HPLC法測定茵杖舒膽顆粒與合劑中 4種大黃蒽醌的含量[J]．中國藥師，2011，14(4):477－479．

Quality Standard of Jinbaoshen Tablets

Wang Shudong,Qian Wenhui,Liao Xin,Yi Wei,Su Hua
(Department of Preparation Division,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command of PLA,Nanjing,Jiangsu,China 210002)

Objective To establish the quality standard of the Jinbaoshen Tablets．M ethods The emodin in Jinbaoshen Tablets was qualitative identified by thin layer chromatography(TLC)method．The contents of captopril,rhein,emodin and chrysophanol in Jinbaoshen Tablets were determined by HPLC and then carried out the verification methodology．Results The TLC spot of emodin were clear,separation was good,and negative control without interference．The liner range of captopril was 18．964 － 94．820 μg ／mL(R2＝ 0．999 8),and the average recovery was 96．97%(n ＝ 9)．The liner range of rhein,emodin and chrysophanol were 2．19 － 17．52 μg ／mL(R2＝ 0．999 9),1．47 － 11．76 μg ／mL(R2＝0．999 9),6．97 － 55．76 μg／mL(R2＝ 0．999 9),and the average recoveries was 102．91%,103．03%,102．06%(n ＝ 9),respectively．Conclusion The established method for the quality standard of the Jinbaoshen Tablets is feasible,has strong specificity and good repeatability,which can be used for the quality control of the preparation．

Jinbaoshen Tablets;captopril;rhein;emodin;chrysophanol;quality standard;TLC;HPLC

R284．1

A

1006－4931(2017)19－0014－05

10．3969 ／j．issn．1006 － 4931．2017．19．004

全軍醫(yī)療機構(gòu)制劑標準提高科研專項課題重點項目[13ZJZ13]。

王曙東（1965－），男，博士研究生，主任藥師，研究方向為醫(yī)院制劑的研究發(fā)，(電子信箱)nzwsd860161＠163．com。

蘇華（1978－），女，碩士研究生，主管藥師，研究方向為醫(yī)院制劑和靶向制劑，（電話）025－80860166（電子信箱）suhuash＠ sina．com。

2016－05－18)