阿帕替尼對宮頸癌HeLa細胞體外放射作用的研究

劉 偉，張建文

（西南醫科大學附屬醫院腫瘤科，四川 瀘州 646000）

阿帕替尼對宮頸癌HeLa細胞體外放射作用的研究

劉 偉，張建文

（西南醫科大學附屬醫院腫瘤科，四川 瀘州 646000）

目的探討阿帕替尼(apatinib，APA)對宮頸癌HeLa細胞體外放射的作用。方法將對數生長期HeLa細胞分為放療組和APA聯合放療組。MTT法檢測APA對HeLa細胞的增殖抑制，以克隆形成試驗觀察放射敏感性。結果APA對HeLa細胞抑制率呈濃度依賴性增加，APA聯合放療組細胞克隆數和細胞存活分數明顯低于放療組，APA的放射增敏比(SERD0)為0．851，SERDq為14．919，SERSF2為1．245。結論體外APA對HeLa細胞有增殖抑制作用，聯合放療有增強亞致死性損傷和細胞死亡協同作用。

阿帕替尼；宮頸癌；HeLa細胞；放射治療；放射敏感性

宮頸癌是女性常見腫瘤之一，2010年和2011年宮頸癌在中國癌癥中居第7位和第10位[1－2]。按國際婦產科聯盟(FIGO)分期，ⅡB 期后患者占 59．21%(45 ／76)[3]。放射治療（簡稱放療）是宮頸癌主要治療措施，單純放療具有較好療效，20年總生存率為 71．93%(123／171)，高于根治性手術 71．51%(123 ／172)，但仍有 27．41%(94 ／343)出現復發[4]。順鉑(cisplatin，DDP)是局部進展期宮頸癌同步放化療常用藥物[5]，但嚴重的胃腸道反應是限制其廣泛應用的主要因素。阿帕替尼(apatinib，APA)作為一種新的抗血管生成藥物，對血管內皮生長因子(VEGF)受體(VEGFR)具有高度選擇性，在宮頸癌中應用研究報道較少，聯合放療是否具有放射增敏作用尚未明確。本研究中觀察了APA聯合放療對宮頸癌的放射增敏作用，為宮頸癌抗血管生成聯合放療提供參考。現報道如下。1 材料與方法

1．1 材料

APA(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，規格為每片0．425 g)；噻唑藍(MTT，美國 Solarbio 公司)；DMEM 高糖培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清（美國HyClone公司）；結晶紫(上海碧云天生物技術有限公司)；人宮頸癌HeLa細胞株(西南醫科大學腫瘤科實驗室提供)；酶標儀（美國BIO－RAD公司）；直線加速器(Elekta)。

1．2 細胞培養與分組

HeLa細胞傳代培養于DMEM培養液中，37℃，5%CO2條件下貼壁生長。取對數生長期HeLa細胞進行試驗。試驗設放療組(RT)和APA聯合放療組(APA＋RT)。

1．3 藥物配制與照射條件

用二甲基亞砜（DMSO）溶液溶解APA，配制成有效質量濃度為3 g／L的APA溶液，于－20℃保存。采用直線加速器照射，SSD＝100 cm，射野40 cm×40 cm，單次照射劑量2 Gy。

1．4 藥物毒作用

1．4．1 APA 的細胞毒作用

HeLa細胞按照4 000個細胞／孔接種于96孔培養板中，分為對照組和藥物處理組，每組均設置5個平行復孔，置孵箱繼續培養，24 h細胞貼壁后，加入含APA或 DDP 的培養基 100 μL，使 APA 濃度為 0，4，8，16，32，64 μmol／L，置孵箱繼續培養 24 h 后，各孔加入 5 g ／L的MTT 20 μL，培養箱內繼續孵育4 h后，吸去培養基，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速均勻地振蕩10 min，采用酶標儀（RT－PCR）下測定每孔490 nm波長處的吸光度值(OD)，計算不同濃度下的抑制率，繪制不同濃度APA對HeLa細胞的生長抑制曲線，采用SPSS 17．0軟件計算APA的抑制濃度(IC50和 IC20)。以上試驗均重復3次。

1．4．2 細胞克隆形成率[6]

每個培養皿中接種 200，300，400，800，1 000 個HeLa細胞，培養12 h（即細胞貼壁）后，藥物聯合放療組分別加入終濃度為 11．46 μmol／L 的 APA，1 μmol／L 的DDP。24 h后對相應組行 0，2，4，6，8 Gy照射，每個劑量設3個平行樣本。繼續培養10～14 d，形成肉眼可見的細胞克隆，終止培養，甲醇固定后沖洗，結晶紫染色。顯微鏡下以≥50個細胞作為1個集落，計算各組平均值及不同照射劑量下存活分數(SF)。試驗重復3次，以平均值進行分析，根據單擊多靶數學模型，采用GraphPad Prism 5軟件擬合HeLa細胞的存活曲線。并求出相應放射生物學參數(D0，Dq，N，SF2)，計算放射增敏比(SERD0)，SERDq和SERSF2，比較不同組間的放射作用。

貼壁率(PE)＝(對照組克隆數／接種細胞數)×100%

SF＝不同劑量組克隆數／(接種細胞數×PE)

2 結果

2．1 APA的 IC50和 IC20

當 APA 有效濃度為 4， 8，16，32， 64 μmol／L 時，相應 的 抑 制 率 分 別 為 12．34% ， 21．05% ， 35．24% ，62．38% ，81．23% ，經計算，APAIC50為 27．160 μmol／L，IC20為 11．462 μmol／L。選擇 IC20作為后續試驗藥物濃度。詳見圖1。

2．2 APA對HeLa細胞的增殖作用

不同濃度APA作用后，APA對HeLa細胞積分光OD隨濃度增加而降低，抑制率隨濃度增加而增加，均表現為濃度依賴性。詳見表1。

2．3 APA對HeLa細胞的放射增敏作用

隨放療劑量增加，兩組細胞克隆數和SF明顯降低，APA＋RT組細胞克隆數和SF明顯低于RT組，且SF2降低0．105。APA＋RT組細胞克隆數和集落大小明顯小于RT組。根據單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，并計算放射生物學參數 Do，Dq，N，SF2及 SER，APA 的 SERD0為 0．851，SERDq為 14．919，SERSF2為 1．245。詳見表 2、表3及圖2。

圖1 APA的細胞毒性

表1 不同濃度APA HeLa細胞積分 OD及抑制率

3 討論

表2 兩組APA作用HeLa細胞后克隆數及SF(±s)

表2 兩組APA作用HeLa細胞后克隆數及SF(±s)

組別 0 Gy 2 Gy 4 Gy RT組APA＋RT組克隆數116．667 ± 3．512 118．667 ± 4．933 SF 1．000 1．000克隆數93．667 ± 4．509 75．333 ± 2．517 SF 0．534 ± 0．026 0．429 ± 0．014克隆數50．333 ± 2．517 45．333 ± 3．055 SF 0．215 ± 0．011 0．194 ± 0．013組別 6 Gy 8 Gy RT組APA＋RT組克隆數47．667 ± 4．509 39．333 ± 3．512 SF 0．102 ± 0．010 0．084 ± 0．008克隆數15．667 ± 3．055 15．333 ± 1．528 SF 0．027 ± 0．005 0．026 ± 0．003

表3 兩組放射生物學參數

目前，臨床常用的抗血管生成藥物主要有重組人血管內皮抑制素、貝伐珠單抗等，這類抗血管生成藥物有明顯腫瘤抑制作用和放射增敏作用。肺癌A549細胞重組人血管內皮抑制素聯合放療研究中，其能明顯抑制肺癌A549細胞株的生長，聯合放療能降低VEGF表達并增強放射敏感性[7]。研究表明，貝伐珠單抗聯合放療能明顯抑制頭頸部腫瘤SCC1及肺癌H226細胞株移植瘤的生長，且能顯著改善惡性膠質瘤患者的無進展生存期和總體生存期[8－9]。APA在肝內膽管細胞癌中作用表明，APA通過抑制VEGF信號自分泌環，促進膽管細胞癌細胞凋亡[10]。APA為2014年才在中國上市的口服抗血管生成藥物，主要用于進展期胃癌的治療[11－12]，缺乏用于宮頸癌治療的報道。

圖2 聯合放療組細胞克隆數和存活曲線

以順鉑為基礎的同步放化療是局部進展期宮頸癌的標準治療模式[13－14]，雖取得了可觀的臨床療效，但嚴重的胃腸道不良反應是患者難以耐受的主要原因。研究表明，在宮頸癌細胞中VEGF－mRNA及VEGF相關蛋白的表達顯著高于正常宮頸細胞，且放療后的宮頸癌細胞VEGF表達進一步增加，從而促進腫瘤細胞增殖、生長、轉移[11，15－16]。因此，抑制 VEGF 相關信號通路可能是宮頸癌治療的另一重要治療手段。抗血管生成藥物是抑制VEGF相關信號通路的主要方式，APA聯合放療是否能增強宮頸癌放射敏感性，有待進一步研究。

APA聯合放療用于腫瘤治療的文獻報道較少，明確僅報道1例胃癌患者APA聯合放療，患者生存16個月，治療期間腫瘤變化明顯[12]，用于更多腫瘤與放療聯合報道缺乏，貝伐珠單抗聯合放療在宮頸癌中可獲得較好療效[17]，但缺乏APA聯合放療用于宮頸癌聯合體內外放療的報道。

本研究結果發現，APA體外放射對Hela細胞存在增殖抑制作用，且呈濃度依耐性。不同濃度APA作用后，APA對HeLa細胞積分 OD隨濃度增加而降低，抑制率隨濃度增加而增加，均表現為濃度依賴性。當APA濃度達到32 μmol／L時，HeLa細胞抑制率成倍增加。APA對腫瘤的增殖抑制作用可能與上調了 P53，caspase－3和caspase－8 的表達有關[18－19]。隨著放療劑量增加，放療組和聯合放療組細胞克隆數和SF2結果與文獻[20]報道相似。APA的SERD0小 于 1(0．851)，但 SERDq和SERSF2均大于 1(分別為 14．919 和 1．245)，提示 APA聯合放療無明顯放射增敏作用，但具有明顯增強亞致死性損傷作用，該作用比放療組高0．863，在相同劑量條件下，具有明顯增強細胞死亡作用，比放療組高0．105。

綜上所述，APA聯合放療具有明顯呈濃度依耐性的增殖抑制作用，雖無明顯放射增敏作用，但有明顯增強亞致死性損傷和細胞死亡協同作用。因此，APA聯合放療具有協同抗腫瘤作用。隨著研究的深入，APA聯合放療在宮頸癌中的作用機制會越來越明顯確，有可能為宮頸癌治療帶來新的希望。

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Radiate Effect of Apatinib on Human Cervical Carcinoma HeLa Cells in Vitro

Liu Wei,Zhang Jianwen
(Department of Oncology,The Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou,Sichuan,China 646000)

Objective To investigate the radiate effect of apatinib(APA)on human cervical carcinoma HeLa cells in vitro．M ethods HeLa cells with logarithmic phase were divided into radiotherapy group and APA combined radiotherapy group．Proliferation inhibition of HeLa cell from APA was detected by MTT,the radiosensitivity of HeLa cell was observed by clone formation assay．Results Proliferation inhibition of HeLa cell from APA was a concentration － dependent increase．Cell clone number and cell survival fraction of the APA combined radiotherapy group were lower than the radiotherapy group．Sensitization enhancement ratio(SERD0)of APA was 0．851,SERDqwas 14．919 and SERSF2was 1．245．Conclusion APA has the proliferation inhibition role to HeLa cell in vitro,combined with radiotherapy can enhance the synergistic effect of sublethal injury and cell death．

apatinib;cervical cancer;HeLa cell;radiotherapy;radiosensitivity

R965．3；R979．1

A

1006－4931(2017)19－0027－04

10．3969 ／j．issn．1006 － 4931．2017．19．007

中國臨床腫瘤學科學基金，CSCO－恒瑞腫瘤研究基金項目[Y－HR2016－046]。

劉偉，男，在讀碩士研究生，研究方向為腫瘤放化綜合治療，（電子信箱）18715798944＠163．com。

張建文，男，主任醫師，碩士研究生，研究方向為腫瘤放化綜合治療，（電子信箱）zhangjianwen66＠126．com。

2017－06－11)