松花粉輔助紫杉醇聯(lián)合鉑類化療的增效減毒作用

趙學友，鞏 萍，孫 銅，馬玉奎

(1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院，山東 臨朐 262600； 2.山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101； 3.山東省藥學科學院，濟南 250100)

研究報告

松花粉輔助紫杉醇聯(lián)合鉑類化療的增效減毒作用

趙學友1，鞏 萍1，孫 銅2，馬玉奎3*

(1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院，山東 臨朐 262600； 2.山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101； 3.山東省藥學科學院，濟南 250100)

目的研究松花粉對紫杉醇聯(lián)合鉑類(paclitaxel and cisplatin, TP)方案化療有無減毒和增效作用。方法取人肺癌H460細胞株制備的移植瘤裸鼠48只，按瘤體積均衡原則分為模型組、松花粉600、300、150 mg/kg三個劑量+TP方案化療組、單用TP方案化療組、單用松花粉600、300、150 mg/kg三個單劑量組，每組6只。各組給予相應的藥物后以裸鼠的體重、進食量、抑瘤率、血液學和肝腎功能等為評價指標，全面評價松花粉對TP化療方案有無增效和減毒作用。結(jié)果模型動物給予TP方案化療的同時灌胃給予松花粉(150、300、600 mg/kg)可明顯提高單用TP化療方案的抑瘤率，抑制化療藥物引起的體重減輕和攝食量的減少、抑制化療引起的白細胞降低和肝腎功能的損傷。結(jié)論TP方案化療的同時給予松花粉具有明顯的增效減毒作用。

松花粉；增效；減毒；肺癌

松花粉(Pini Pollen)藥名松花、松黃，最早記載于唐代的《新修本草》。松花粉是我國傳統(tǒng)藥材，可藥食兼用的花粉品種，在我國具有悠久的藥用歷史。《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中均記載其“氣味甘平無毒”，具有潤心肺、益氣、利小便、消瘀血等功效，亦可用于釀酒。松花粉富含蛋白質(zhì)、磷脂、礦物質(zhì)和多種維生素和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。現(xiàn)代藥理研究證明，松花粉具有降脂、延緩衰老、美容養(yǎng)顏、保肝、降糖、提高機體免疫力等眾多功效[2]。 盡管研究證明眾多中藥均具有抗腫瘤作用，但單味中藥用于抗腫瘤臨床上幾乎沒有確切療效，臨床一般多輔助化療藥物應用[3]。故本文采用人肺癌H460裸鼠移植瘤模型初步考察了松花粉對TP方案化療的增效和減毒作用，為松花粉進一步研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1實驗動物及瘤珠

BALB/c裸鼠，雄性，SPF級，4周齡，15～17 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]提供。飼養(yǎng)于山東省藥學科學院獨立送風IVC籠具中[SYXK(魯) 2010-0005]。室溫20℃ ～23℃，相對濕度 40% ～60%。本實驗經(jīng)過山東省藥學科學院新藥評價中心實驗動物使用與管理委員會審查，編號為IACUC-2015068。人肺癌H460細胞系，濟南天長商貿(mào)有限公司提供。

1.2主要試劑與儀器

松花粉(批號：14010412，煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司)；紫杉醇注射液(TAX，批號：E1400520，江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司)；注射用順鉑(CDDP，批號：140728，上海新百合藥業(yè)股份有限公司)。

Hemavet 950型全自動血球計數(shù)儀(Drew Scientific公司)；日立7180全自動生化分析儀(日本株式會社日立高新技術(shù))；BPN-50CH(UV)二氧化碳培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；XSP-18C型倒置生物顯微鏡(上海巴拓儀器有限公司)；電子數(shù)顯卡尺(深圳市格雷創(chuàng)科技有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1 裸鼠移植瘤模型建立及動物分組

常規(guī)傳代培養(yǎng)人肺癌H460細胞，收集細胞懸液后調(diào)整細胞數(shù)為每毫升1.0×108～2.0×108個細胞。在無菌條件下將腫瘤細胞接種于裸鼠右腋皮下，每只0.1 mL。接種后定期測量腫瘤長徑、寬徑和高，計算瘤體積(V=3. 14×寬徑×長徑×高/6)[4]，當腫瘤體積為150～300 mm3時，按瘤體積均衡原則分為模型組、松花粉600、300、150 mg/kg三個劑量+TP方案化療組、單用TP方案化療組、單用松花粉600、300、150 mg/kg三個單劑量組，每組6只。

1.3.2 分組后給藥

松花粉各劑量組裸鼠每天灌胃1次，給予相應劑量的藥物溶液，連續(xù)給藥21 d；TP方案化療組于分組后第8天和16天按照16 mg/kg劑量各腹腔注射1次TAX，第10、12和14天按照6.7 mg/kg劑量各腹腔注射1次CDDP。松花粉+TP方案化療組在給予TP方案化療的基礎上給予松花粉；模型組灌胃給予等體積的純水和腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉注射液。

1.3.3 結(jié)果檢測和評價

體重和飼料消耗量每3 d稱量1次，21 d藥后3 h戊巴比妥鈉麻醉后腹主動脈采血，檢測主要血液學指標：紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血紅蛋白 (HB)和肝腎功能指標：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)。采血后取每只動物的瘤塊并稱瘤重，按下面公式計算出抑瘤率和q值[5,6]。

腫瘤抑制率=(A-B)/A×100%，B為藥物組平均瘤重，A為模型組平均瘤重。

q值=E(ab)/[Ea+(1-Ea) ×Eb]，E(ab)為兩種藥物合用的腫瘤抑制率，Ea、Eb為兩種藥物單用的腫瘤抑制率，q大于0.85提示兩種藥物合用有協(xié)同作用。

1.4統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1松花粉對化療裸鼠攝食量的影響

裸鼠給予化療藥物后攝食量減少，而同時給予松花粉后，裸鼠攝食量隨著給藥時間延長逐漸恢復，其中給藥21 d后化療和松花粉300、600 mg/kg合用組裸鼠的攝食量與模型組基本一致。見表1。

2.2松花粉對化療裸鼠體重的影響

TP方案化療后裸鼠體重逐漸減輕，自12 d開始體重明顯低于模型組(P﹤0.05)，而同時給予松花粉后，裸鼠體重隨給藥時間延長逐漸恢復，給藥21 d后體重明顯高于TP化療組(P﹤0.05)，而與模型組體重基本一致。結(jié)果見表2。

2.3松花粉對化療藥物的增效作用

與模型組比較，松花粉和TP方案化療合用后瘤重明顯減輕，抑瘤率明顯高于化療或松花粉單用組，其中松花粉300、600 mg/kg和化療合用后q值大于0.85，說明松花粉在300 mg/kg以上劑量時可明顯增強TP方案化療的抗腫瘤作用。結(jié)果見表3。

表1 松花粉對裸鼠攝食量的影響(n=6)

Tab.2Effects of Pini Pollen on body weight of the model nude mice

組 別Groups劑量/mg/kgDoses體重/g Bodyweight0d6d12d18d21d模型Model—232±17246±20248±17259±19263±17紫杉醇+順鉑Paclitaxel+Cisplatin16+67231±19232±18218±19?212±18?210±21?松花粉+紫杉醇+順鉑PiniPollen+Paclitaxel+Cisplatin600+16+67235±16233±16224±12237±21#242±21#300+16+67230±22229±19222±16234±20#239±19#150+16+67236±20230±18219±16223±15234±14#

注：與模型組比較,*P﹤0.05；與TP組比較,#P﹤0.05。

Note.*P﹤0.05,vs the model group；#P﹤0.05, vs the TP group.

Tab.3Synergistic effects of Pini Pollen on chemotherapy in the model nude mice

組 別Groups劑量/mg/kgDoses瘤重/gTumorweight抑瘤率/%Tumorinhibitionrateq值qvalue模型Model—152±043 ——紫杉醇+順鉑Paclitaxel+Cisplatin16+67070±016?539—松花粉PiniPollen600098±016?##355—300108±026#289—150112±032#263—松花粉+紫杉醇+順鉑PiniPollen+Paclitaxel+Cisplatin600+16+67038±017??750107300+16+67056±026??632094150+16+67068±015?553084

注：與模型組比較,*P﹤0.05,**P﹤0.01; 與松花粉+TP組比較,#P﹤0.05,##P﹤0.01。

Note.*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs the model group；#P﹤0.05,##P﹤0.01 vs the Pini Pollen plus TP group.

Tab.4Attenuation effects of Pini Pollen on hematological and blood biochemical toxicity caused by chemotherapy in the model nude mice

組 別Groups劑量/mg/kgDosesWBC/109/LRBC/1012/LHB/g/LALT/U/LAST/U/LCR/μmol/LBUN/mmol/L模型Model—731±099101±15136±21691±1781487±194300±3569±12紫杉醇+順鉑Paclitaxel+Cisplatin16+67451±067??91±09120±221250±299?2211±324??542±40??107±20?松花粉+紫杉醇+順鉑PiniPollen+Paclitaxel+Cisplatin600+16+67688±195#104±20126±21791±211#1623±215#351±76#79±11#300+16+67631±099#98±16113±19855±178#1802±243#419±68#83±12#150+16+67560±122?100±20122±10982±254?1972±310?461±64??87±21

注：與模型組比較,*P﹤0.05,**P﹤0.01；與TP化療藥物組比較,#P﹤0.05。

Note.*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs the model group；#P﹤0.05, vs the TP group.

2.4松花粉對化療引起的血液學和血液生化學毒性減毒作用

與模型組比較，裸鼠WBC數(shù)量化療后明顯減少，血清中ALT、AST、CR和BUN含量明顯升高，與單用化療藥物組比較，同時給予松花粉300、600 mg/kg后裸鼠WBC數(shù)量明顯增多，血清中ALT、AST、CR和BUN含量明顯降低(P﹤0.05)，說明松花粉在300 mg/kg以上劑量可明顯抑制TP方案化療藥物引起的白細胞減少和肝腎功能損傷。各個劑量對RBC和HB無明顯影響。結(jié)果見表4。

3 討論

我國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升，我國每年新發(fā)腫瘤病例300多萬，腫瘤病人死亡人數(shù)占全球的四分之一左右，已成人類死亡的主要原因[7]。臨床上根據(jù)腫瘤的不同生長部位、不同病理類型、不同分期、患者的具體情況等會選擇化療、放療、手術(shù)治療以及中醫(yī)藥治療等不同的治療方式。其中，化療時最常用的治療方式，但多數(shù)化療藥物存在選擇性差，毒副作用大，容易耐藥等缺陷，嚴重制約著化療的效果。而中醫(yī)藥治療具有多靶點和多環(huán)節(jié)效應以及副作用小等化藥不具有的優(yōu)勢，但也存在諸如治療的腫瘤和療效有限、作用機制不明確等眾多缺陷，故臨床上中藥多與化療藥物合用，通過增強機體免疫力、活血化瘀、扶正驅(qū)邪、補氣養(yǎng)血、清熱解毒、調(diào)理臟腑等多個方面增強化療藥物療效的同時降低毒副反應，改善腫瘤患者的生活狀態(tài)，提高腫瘤患者化療的耐受性等[8,9]。

選擇合適的實驗動物模型是新藥藥效評價的重要一環(huán)，目前抗腫瘤藥物的增效減毒作用研究多采用S180腹水癌小鼠模型，研究對于環(huán)磷酰胺等單個化療藥物的輔助作用，但此模型與臨床實際應用存在較大差異，例如腫瘤細胞來源為鼠源性而非人源性瘤株，臨床化療一般不會單個藥物而多采用多種化療藥物聯(lián)合應用等。因此本文采用了人源性的H460非小細胞肺癌瘤珠制備裸鼠移植瘤模型，給予非小細胞肺癌國際治療指南中推薦的TP標準化療方案，選擇抑瘤率作為增效指標，化療最常見的食欲不振、體重減輕、白細胞減少和肝腎功能損傷作為減毒指標，初步模擬臨床治療現(xiàn)狀來研究松花粉的增效減毒作用。

本實驗研究結(jié)果證明，裸鼠給予TP方案化療后出現(xiàn)了體重減輕、進食量減少、WBC減少、肝腎功能受損等臨床腫瘤病人化療后最容易出現(xiàn)的不良反應，說明此模型復制成功，能夠較好地模擬臨床實際。化療的同時灌胃給予松花粉后，不良反應明顯減輕，體重和進食量隨著給藥次數(shù)增多逐漸恢復正常。與TP方案化療組小鼠比較，合用松花粉21d時檢測WBC數(shù)量明顯增多，血清中AST、ALT、CR、BUN含量明顯降低，說明松花粉對血液系統(tǒng)和肝腎功能具有明顯保護作用。抑瘤效果顯示，TP方案化療和松花粉合用后，與單純TP方案化療相比，對H460裸鼠移植瘤的抑瘤效果顯著增強。本實驗結(jié)果初步證明，松花粉對化療藥物具有明顯的增效和減毒作用，其作用可能與松花粉具有抗氧化、保肝、提高免疫力、抗腫瘤作用有關[2,10]，其確切的作用機制仍有待于進一步研究。

[1] 何曉燕,孫雪園,于智洋.松花粉的營養(yǎng)成分及藥理作用[J].東北林業(yè)大學學報, 2007, 35(9): 78-80.

[2] 謝嬌,王華,任廷遠,等.松花粉的功效及應用展望[J].食品與藥品, 2011, 12(3):139-141.

[3] 木拉提·扎依別克,哈木拉提·吾普爾.抗腫瘤中藥的分類及作用機理[J].新疆醫(yī)科大學學報,2006, 29(11): 1102-1104.

[4] 何志軍,陳先祥,蔡慶和,等.移植瘤體積不同計算方法的比較[J].中國比較醫(yī)學雜志, 2009,19(9): 47-50.

[5] 王作軍,馬玉奎,賈玉萍,等.毛蚶提取物輔助 NP 化療的增效減毒作用[J].中國比較醫(yī)學雜志, 2015, 25(5):37-40.

[6] 陳穎,茅蕾蕾,胡碧原,等.銀杏外種皮提取物聯(lián)合順鉑對S180荷瘤小鼠抗腫瘤增效減毒作用[J].中國新藥雜志, 2014, 23(13): 1569-1572.

[7] 吳菲,林國幀,張晉昕.我國惡性腫瘤發(fā)病現(xiàn)狀及趨勢[J]．中國腫瘤, 2012, 21(2): 81-85．

[8] 孫菲.中藥抗腫瘤作用及機制研究進展[J].中國民族民間醫(yī)藥, 2016, 25(17): 48-54.

[9] 張順辰,要曉靜.中藥抗腫瘤作用的研究進展[J].中國處方藥, 2015, 13(5):19-20.

[10] 李雯雯, 陳才法, 李悅, 等.松花粉醇提物抗腫瘤作用的初步研究[J].解放軍藥學學報, 2011, 27(3):199-201.

SynergismandattenuationeffectsofPiniPollenonpaclitaxelandcisplatinechemotherapy

ZHAO Xue-you1， GONG Ping1， SUN Tong2， MA Yu-kui3*

(1.People’s Hospital of Linqu County, Linqu 262600，China； 2.Shandong Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101； 3.Shandong Pharmaceutical Academy, Jinan 250100)

ObjectiveTo investigate the synergism and attenuation effects of Pini Pollen on paclitaxel and cisplatin (TP) chemotherapy in model mice.MethodsForty-eight model nude mice with H456 cell line xenograft were divided into 8 groups: model group, TP chemotherapy group, Pini Pollen (150, 300 and 600 mg/kg)group and TP chemotherapy plus Pini Pollen (150, 300 and 600 mg/kg)group. The tumor inhibition rates, body weight, food intake, hematology and blood biochemistry indexes were selected to evaluate the synergism and attenuation effects of intragastric administration of Pini Pollen (150,300,600 mg/kg) on TP chemotherapy.ResultsCompared with the TP chemotherapy group, the tumor inhibition rates, body weight, food intake, white blood cell count were increased and liver and kidney function damage were alleviated significantly in the TP chemotherapy plus Pini Pollen groups.ConclusionsPini Pollen has a significant synergism and attenuation effects on TP chemotherapy.

Pini Pollen; Synergism; Attenuation; Lung Cancer

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0047-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.009

2017-02-06

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(2014ZZCX02104)。

趙學友(1975-)，男，主管藥師，本科， 研究方向：臨床藥學。E-mail: yaoliduli@163.com

馬玉奎 (1975-)，男，主任藥師，博士，研究方向：新藥藥理毒理評價。 E-mail: yukuima@sina.com