釩暴露對大鼠小膠質細胞炎癥反應和遷移的影響

余曉巍，胡楚元，熊志軍

(湖南省職業病防治院，長沙 410003)

研究報告

釩暴露對大鼠小膠質細胞炎癥反應和遷移的影響

余曉巍，胡楚元，熊志軍

(湖南省職業病防治院，長沙 410003)

目的觀察偏釩酸鈉(NaVO3·2H2O)暴露對小膠質細胞炎癥反應和遷移的影響，探討釩神經毒性的相關機制。方法偏釩酸鈉孵育原代培養的SD大鼠小膠質細胞，免疫熒光技術顯示小膠質細胞形態的變化及其特異性標志物Iba1的表達，免疫印跡技術檢測iNOS、COX-2、ERK和p-ERK蛋白表達，酶聯免疫吸附實驗檢測炎癥因子TNF-α，IL-1β的釋放水平；構建劃痕遷移模型，免疫熒光技術記錄偏釩酸鈉對小膠質細胞遷移的影響。結果偏釩酸鈉孵育小膠質細胞后，神經小膠質細胞形態由靜息態的分支狀向吞噬細胞樣形態轉變，其特異性標志物Iba1表達顯著增加；iNOS和COX-2的蛋白表達和TNF-α，IL-1β釋放水平與對照組相比較均顯著升高；偏釩酸鈉促進小膠質細胞的遷移。結論偏釩酸鈉顯著促進了小膠質細胞的炎癥反應和遷移。

偏釩酸鈉；小膠質細胞；炎性反應；遷移

釩是地球上廣泛分布的微量元素。釩的大量開發與應用引發的環境問題日益嚴重，生產過程中產生的廢氣成為大氣中釩的重要來源[1,2]，廠區及附近的土壤、水源大都受到污染，尤以釩、錳、銅、鉛為主[3,4]，存在嚴重職業危害與環境污染。國內外研究顯示，釩具有神經毒性[5]，有研究發現釩甚至可以直接進入中樞神經系統，導致明顯的神經毒性[6]。小膠質細胞是中樞免疫細胞，在正常生理狀態下處“靜息”狀態，它們通過持續監控微環境的變化維持內環境的穩態[7]。而當中樞神經系統受損時，小膠質細胞被迅速“激活”并對外界刺激做出反應，如遷移、增殖、形態改變(從分枝狀轉變為阿米巴狀)、釋放免疫因子和炎性介質，并參與細胞碎片吞噬[8,9]，這些作用對神經元的損傷和修復具有雙重影響[10,11]。因此本研究擬通過觀察釩暴露對原代培養大鼠小膠質細胞炎性反應和遷移的影響，探討釩神經毒性的相關機制，以期為釩暴露導致的神經元損傷提供應對策略。

1 材料和方法

1.1實驗動物

雌性SD乳鼠(出生24 h內)，體重6.5～9.0 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]，在湖南省職業病防治院毒理學實驗室[SYXK(湘)2014-0003]進行實驗。經實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準[湘職防(2014)倫研批第006號]。

1.2主要試劑

偏釩酸鈉(NaVO3·2H2O)：分析純，購自天津市光復精細化工研究所；iNOS和COX-2抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，OX- 42、Iba1、Hoechst 33258、ERK和p-ERK購自英國Abcam公司；熒光標記二抗、FITC和羅丹明購自美國Thermo Fisher公司；DMEM培養基和胰蛋白酶購自美國Hylone公司； ELISA試劑盒(TNF-α、IL-1β)購自北京中杉金橋公司。

1.3實驗方法

1.3.1 大鼠皮層原代小膠質細胞的制備

將新生SD乳鼠在無菌條件下斷頭、開顱取腦后，置于冷PBS溶液中。分離大腦皮層、剪碎，0.125%的胰酶溶液于37℃消化20 min，2層紗布過濾后接種于多聚賴氨酸預先包被的75 mL培養瓶中，置于37℃，5% CO2培養箱中培養24 h后全量換液。之后每3 d換液一次，第14天將培養瓶旋緊密封，固定于37℃恒溫水平搖床內，以220 r/min振蕩3 h，收集脫落細胞懸液，接種于培養皿中，貼壁1 h后去除未貼壁細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM繼續培養。

1.3.2 小膠質細胞的鑒定

細胞爬片后，按免疫熒光法，用OX-42抗體標記細胞，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 免疫熒光檢測小膠質細胞形態學的變化

細胞爬片后，25 μmol/L的偏釩酸鈉孵育小膠質細胞12 h，用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗3次，每次10 min，0.3% Triton X-100室溫處理30 min后，加3% BSA室溫封閉30 min；加入Iba1抗體(1∶200)，4℃過夜；次日，PBS浸洗3次，每次10 min，加FITC標記熒光二抗或羅丹明，室溫孵育1 h；PBS浸洗3次，每次10 min，甘油封片后，置于奧林巴斯FV1000熒光顯微鏡下觀察、拍照。采用奧林巴斯FV10-ASW顯微攝影圖像分析系統攝取免疫熒光圖像，隨機測定5個視野細胞熒光強度，實驗均重復5次(n=5)。

1.3.4 劃痕遷移實驗

在24孔板中按照5×105/孔進行細胞爬片后，用1 mL吸管尖端在玻片上進行劃痕，用DMEM培養基浸洗3次后，25 μM的偏釩酸鈉孵育小膠質細胞12 h，按免疫熒光法，用OX-42抗體標記細胞，置于奧林巴斯FV1000熒光顯微鏡下觀察、拍照，并計算進入劃痕區域的細胞數量。每次隨機選取5個視野，取平均值作為1個樣本。每次實驗均重復 5 次；按免疫印跡法，檢測 ERK和p-ERK蛋白表達，每次實驗均重復3次(n=3)。

1.3.5 免疫印跡實驗檢測iNOS、COX-2蛋白表達

將小膠質細胞接種于6孔培養板，培養24 h，加入25 μM 的偏釩酸鈉處理，分別于6、12和24 h后，經胰酶消化收集細胞，提取總蛋白。根據 BCA 蛋白定量試劑盒的說明蛋白定量后，進行10% SDS-PAGE電泳，然后100 mA 3.5 h電轉至PVDF膜上，用濃度為5%的脫脂奶粉封閉1 h后，用PBST洗膜3次，每次10 min；將PVDF膜放入稀釋好的iNOS抗體(1∶1000)、COX-2抗體(1∶500)中，4℃過夜；次日用PBST洗膜3次，每次10 min，將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000稀釋)中，室溫孵育2 h；PBST洗膜3次，每次20 min；加ECL發光劑孵育，在3 ～15 min內顯影、定影，分析。每次實驗均重復3次(n=3)。

1.3.6 酶聯免疫吸附試驗

將小膠質細胞接種于6孔培養板，培養24 h，加入25 μM 的偏釩酸鈉處理，分別于6、12和24 h后收集細胞培養液，根據ELISA試劑盒說明書的相關步驟檢測細胞培養液中炎性因子 TNF-α、IL-1β含量的變化。

注：(A)OX- 42標記的小膠質細胞；(B)Hoechst 33258標記的細胞核；(C)A+B組合；(D)小膠質細胞對照組；(E)偏釩酸鈉處理組(25 μmol/L)；與對照組比較，** P< 0.01。圖1 小膠質細胞鑒定以及偏釩酸鈉對小膠質細胞形態學的影響Note.(A)Microglia labeled with OX- 42；(B)Cell nuclei labeled with Hoechst 33258；(C)Merged A and B；(D)Control group;(E)NaVO3·2H2O exposure group (25 μmol/L); Compared with the control group, ** P< 0.01.Fig.1 Microglia identification and the effect of NaVO3·2H2O on the morphology of microglia

1.4統計學方法

2 結果

2.1原代小膠質細胞的鑒定

小膠質細胞所占總體細胞比例達到99%以上，表明SD大鼠皮層原代小膠質細胞分離純化成功(圖1)。

2.2偏釩酸鈉暴露對小膠質細胞形態的影響

未經處理的小膠質細胞形態呈現為細長分枝狀，25 μM的偏釩酸鈉孵育小膠質細胞12 h后，小膠質細胞形態由細長分枝狀轉變為阿米巴狀，表現為突起回縮和形態變圓25 μM的偏釩酸鈉孵育小膠質細胞12 h，Iba1的相對熒光強度與對照組比較顯著增加，差異有顯著性(P< 0.01)，表明小膠質細胞被顯著激活(圖1)。

2.3偏釩酸鈉暴露對小膠質細胞遷移的影響

與對照組比較，25 μM 的偏釩酸鈉處理小膠質細胞12 h顯著上調了ERK磷酸化水平，并增強了小膠質細胞的遷移能力，差異有顯著性(P< 0.01)(圖2)。

2.4偏釩酸鈉暴露對小膠質細胞釋放炎癥因子的影響

小膠質細胞在靜息狀態時幾乎不表達iNOS和COX-2，25 μM 偏釩酸鈉處理的小膠質細胞炎癥因子iNOS和COX-2的蛋白表達水平隨時間的延長增加(P< 0.05或P< 0.01)(圖3)。

小膠質細胞在靜息狀態時分泌少量TNF-α和IL-1β，在被偏釩酸鈉激活后，小膠質細胞大量分泌TNF-α和IL-1β，且隨時間的延長顯著增加，與對照組比較，差異有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)(表1)。

注：(A)免疫熒光檢測小膠質細胞遷移情況；(B)小膠質細胞遷移數目統計分析；(C)免疫印跡實驗檢測p-ERK蛋白表達情況；與對照組比較，** P< 0.01。圖2 偏釩酸鈉對小膠質細胞遷移以及ERK磷酸化水平的影響Note:(A)Representative photomicrographs of the migrating cells before and after treatment with a NaVO3·2H2O (25 μM);(B)Statistical analysis of the number of microglia migration;(C)The expression of p-ERK determined by Western blotting analysis；Compared with the control group,** P< 0.01.Fig.2 Effect of NaVO3·2H2O on microglial migration and the expression of p-ERK

注：(A)免疫印跡實驗檢測小膠質細胞iNOS和COX-2蛋白表達；(B)灰度值統計分析；與對照組比較，* P< 0.05，** P< 0.01。圖3 各組間小膠質細胞iNOS和COX-2的蛋白表達情況Note:(A)The expression of iNOS and COX-2 by Western blotting analysis;(B)Statistical analysis of the gray value；Compared with control grouo, * P< 0.05，** P< 0.01.Fig.3 The expression of iNOS and COX-2 in different groups

Tab.1Comparison of TNF-α and IL-1β levels in the supernatant of microglial cultures in different groups

分組GroupsTNF?αIL?1β對照組Controlgroup4449±10．734963±14．58偏釩酸鈉6h處理組NaVO3·2H2Ofor6h9549±10．73?8363±14．58?偏釩酸鈉12h處理組NaVO3·2H2Ofor12h15949±10．73??25763±14．58??偏釩酸鈉24h處理組NaVO3·2H2Ofor24h24574±6．69??27963±14．58??

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

3 討論

釩的毒性研究較多地集中在致畸，致癌，致突變作用方面。相比之下，對釩的神經毒性研究開展得相對有限和缺乏。越來越多的研究表明，釩具有神經毒性效應[12,13]，釩甚至可以直接進入中樞神經系統，導致明顯的神經毒性，例如神經衰弱、不安、震顫、狂躁癥、抑郁癥等[6]。近來，研究還發現受到釩刺激的少突膠質細胞和星形膠質細胞會產生大量的ROS而受損[14]，少突膠質細胞是神經元髓鞘的重要組成部分，星形膠質細胞對于神經元發揮生理功能也是不可或缺。小膠質細胞是中樞神經系統內的固有免疫細胞，它在神經元的生存和整個生命活動中起著十分重要的作用[7]。而關于釩對小膠質細胞的相關作用目前尚未見任何報道。

遷移是小膠質細胞應對炎癥刺激的一個重要的功能，ERK磷酸化在小膠質細胞的遷移中發揮關鍵性的調節作用[15]。本研究發現，偏釩酸鈉誘導的小膠質細胞形態發生明顯改變，細胞突起長度縮短、變圓，伴隨著遷移能力的增強，其特異性標志物Iba1蛋白表達也明顯增加。而Iba1蛋白屬EF手性蛋白，是小膠質細胞和巨噬細胞的特異性表面標記物，因腦組織巨噬細胞含量極少，檢測Iba1可視為特異性檢測小膠質細胞。隨著小膠質細胞的激活，Iba1的表達顯著增加。這些指標表明偏釩酸鈉誘導小膠質細胞活化，而激活的小膠質細胞是介導中樞炎癥反應主要的細胞。小膠質細胞介導的神經炎癥是一把雙刃劍：精密調控下的神經炎癥反應啟動后可以發揮吞噬和修復的作用，最終恢復組織內環境的平衡[16,17]；而過度的炎癥反應使得小膠質細胞上調多種細胞表面受體，釋放多種細胞因子，如炎癥因子TNF-α、IL-1β、NO和活性氧類物質等，這些炎癥介質不但對神經元產生毒性，還通過級聯放大效應使得小膠質細胞產生更多的毒性因子，從而加劇神經毒性作用。而本研究發現，在偏釩酸鈉作用下，小膠質細胞表達大量的炎性因子如iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β，并隨著作用時間的延長而顯著增加。

中樞神經系統中，iNOS主要存在于小膠質細胞和星形膠質細胞，過度激活的小膠質細胞生成大量的iNOS，進而導致高濃度的NO的生成，高濃度的NO能夠抑制線粒體呼吸功能和糖酵解、抑制DNA合成、損害DNA結構、與超氧陰離子自由基反應生成過氧亞硝基，產生神經毒性作用[18]。COX-2為誘導型酶，正常生理狀態下不表達，在受到炎癥刺激時誘發性的高表達。COX-2除了本身具有一定的促炎作用之外，與iNOS之間存在“交互感應”。COX-2是NO合成的上游關鍵酶分子，而在炎性狀態下，NO能夠通過NO/cGMP通路上調COX-2的表達。TNF-α是小膠質細胞炎癥反應釋放的主要的炎性細胞因子，在神經毒性中發揮重要作用。已有研究表明，TNF-α可激活小膠質細胞上的TNF-α 受體從而啟動級聯反應，導致其它促炎因子如iNOS、COX-2等的合成，最終導致神經元的損傷、變性甚至死亡[19]。此外TNF-α可促進星形膠質細胞產生趨化因子和黏附分子，促進炎癥因子如IL-1β、IL-6的產生，導致炎癥的惡性循環[20]。IL-1β是中樞炎癥級聯反應中的關鍵因子，其不僅可以通過NF-κB途徑進一步促進小膠質細胞的激活，還具有自分泌作用，進而通過炎癥因子的級聯放大反應，加重炎癥損傷，促進神經毒性作用。這些炎性因子存在著一定程度的相互作用機制，共同促進炎癥的發展。本研究顯示小膠質細胞能夠被偏釩酸鈉激活，表達及高分泌iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β。

綜上所述，釩暴露可在體外激活原代培養的小膠質細胞，導致炎癥因子的大量表達，并顯著促進小膠質細胞的遷移，為進一步深入研究偏釩酸鈉的神經毒性機制奠定基礎。

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Exposuretovanadiumpromotesprimaryculturedratmicroglialinflammationandmigration

YU Xiao-wei， HU Chu-yuan， XIONG Zhi-jun

(Hunan Prevention and Treatment Institute for Occupational Diseases, Changsha 410003, China)

ObjectiveTo observe the changes of rat microglial inflammation and migration after exposure to sodium metavanadate(NaVO3·2H2O), and to analyze the possible mechanisms of vanadium neurotoxicity.MethodsPrimary cultured rat microglial cells were incubated with NaVO3·2H2O. Morphological changes and the Iba1 expression of microglia were tested by immunofluorescence assay. iNOS, Cox-2, ERK and p-ERK protein expressions were determined by western blotting. The levels of TNF-α and IL-1β in the culture medium were tested by enzyme-linked immunosorbent assay. The migration of microglia was tested by immunofluorescence staining using wound-healing assay.ResultsMicroglia changed from resting state with ramous shape to round shape in activated state after NaVO3·2H2O exposure, and the expression of Iba1 increased obviously. The protein expressions of iNOS and COX-2 increased significantly compared with the control. The levels of TNF-α and IL-1β were also increased significantly. NaVO3·2H2O promotes the migration of microglia through ERK pathway.ConclusionsExposure to NaVO3·2H2O promotes primary cultured rat microglial inflammation and migration. These results suggest that the inflammatory reaction of microglia may be one of the possible mechanisms of neurotoxicity caused by vanadium exposure.

Sodium metavanadate; Microglia; Inflammatory reaction; Migration

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0055-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.011

2017-02-18

湖南省衛生與計劃生育委員會科研基金(B2015-318)。

余曉巍(1984-)，男，醫學博士，主管藥師，研究方向：毒理學研究。E-mail: yuxw0714@163.com