廣東省實驗用小型豬主要病原微生物學及寄生蟲學調查

黃樹武，閔凡貴，吳瑞可，陳梅玲，王希龍*，潘金春*

(1.廣東省實驗動物監測所，廣州 510663； 2.廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

研究報告

廣東省實驗用小型豬主要病原微生物學及寄生蟲學調查

黃樹武1,2，閔凡貴1,2，吳瑞可1,2，陳梅玲1,2，王希龍1,2*，潘金春1,2*

(1.廣東省實驗動物監測所，廣州 510663； 2.廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

目的調查廣東省實驗用小型豬主要病原微生物和寄生蟲的感染情況。方法從廣東省4家生產單位隨機抽取小型豬154頭，包括巴馬小型豬、蕨麻小型豬、西藏小型豬和五指山小型豬4種品系，采集皮毛、鱗屑、血清、肛拭子、糞便等樣品檢測20種病原，對結果進行生產單位和品系間的差異性分析。結果所檢4家單位的所有品系小型豬均存在多種病原復合感染，豬鏈球菌2型(50.7%)、胸膜肺炎放線桿菌(40.3%)、肺炎支原體(100.0%)、乙型腦炎病毒(41.3%)、豬圓環病毒2型(74.8%)、豬傳染性胃腸炎病毒(73.8%)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(44.7%)7種病原的檢出率相對較高，豬細小病毒(26.0%)、豬偽狂犬病病毒(15.6%)、腸道中蠕蟲(3.2%)有一定檢出率；要求強免的豬瘟病毒(62.8%)、口蹄疫病毒(35.8%)免疫合格率較低，豬偽狂犬病病毒免疫合格率高達98.4%。本次調查未檢出沙門氏菌、布魯氏菌、豬痢疾蛇樣螺旋體、皮膚病原真菌、甲型流感病毒、弓形蟲、體外寄生蟲和糞便球蟲。結論廣東地區存欄實驗用小型豬存在多種病原復合感染，需加強免疫和質量控制，逐步建立高等級群體；同時也為實驗用小型豬地方標準乃至國家標準的制/修訂提供了依據。

實驗用小型豬；病原菌；病毒；寄生蟲；調查

研究證明，豬在藥代動力學、生理學、生物化學和解剖學等多個方面與人類非常相似[1]，是一種理想的實驗動物，可替代犬、猴用于器官移植、外科模型、教學和藥物臨床前評價等生物醫學研究[2]。小型豬由于具有體小、操作方便等優點，已經在生命科學研究的各個領域得到廣泛應用，日益成為一種理想的實驗動物，然而我國尚未有實驗用小型豬相應的國家標準，僅北京、上海、廣西、江蘇等地方提出了地方標準，且各地標準存在較大差異[3-6]，在一定程度上阻礙了小型豬的實驗動物標準化研究和推廣應用。由于廣東省缺乏實驗用小型豬的地方標準，并且制標、立標的周期長，目前廣東省實驗動物行政許可需要對外來地方標準進行確認，鑒于各地已有地方標準規定的技術指標差異很大，對廣東地區的適用性需要進行科學探討。

此前，國內有研究人員對部分地區的實驗用小型豬病原攜帶情況進行了調查，顯示病原攜帶情況除與品系相關外，還具有區域性特點[7-10]。目前，尚無關于廣東地區實驗用小型豬流行病調查的相關報道。本研究通過對廣東地區小型豬繁殖基地生產的小型豬進行人獸共患病和高發病原的流行病學調查，旨在了解實驗用小型豬感染性疾病的病原攜帶狀況及其分布特點，為小型豬的質量檢測、廣東省地方標準乃至國家標準的制定提供依據。

1 材料和方法

1.1實驗動物

本研究抽樣調查的實驗動物來自廣東省4家實驗用小型豬生產單位(用代號A、B、C、D單位表示)，共抽取154頭小型豬，品系包括巴馬小型豬(bama minipig,BMP)、蕨麻小型豬(Juema minipig,JMP)、西藏小型豬(Tibet minipig,XZP)和五指山小型豬(Wuzhishan minipig,WZSP)。具體抽樣信息見表1。

1.2主要試劑與儀器

DHL平板、沙氏瓊脂平板購自廣東環凱微生物科技有限公司；肛拭子運送培養基購自廣州陽普醫療科技股份有限公司；ID 32E鑒定條、氧化酶試劑購自法國生物梅里埃股份有限公司；三糖鐵、半固體瓊脂購自北京陸橋技術股份有限公司；糖發酵培養基、氨基酸脫羧酶試驗培養基、氰化鉀培養基、蛋白胨水、靛基質試劑購自杭州濱和微生物試劑有限公司；鼠傷害沙門菌(CMCC50115)購自廣東省微生物菌種保藏中心；沙門多價診斷血清購自寧波天和微生物試劑有限公司；布氏桿菌試管凝集抗原購自中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所；豬ELISA試劑盒購自TSZ公司和武漢科前生物股份有限公司；弓形蟲間接血凝試驗檢測試劑購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所；DNA抽提試劑，豬痢疾蛇樣螺旋體熒光PCR檢測試劑盒購自廣州旭牧生物科技有限公司；無水乙醇購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 不同生產單位抽樣調查的實驗用小型豬品系及數量

生化培養箱(寧波江南儀器廠，SPX-288型)；生物安全柜(德國，Biometra型)；ATB梅里埃鑒定儀(法國，ATB NEW型)；離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，TG16-W型)；恒溫搖床(寧波江南儀器廠，KYC100型)；生物顯微鏡(德國，Leica DM500型)；酶標儀(美國，Bio-rad 680型)；酶標洗板機(北京拓普分析儀器公司，DEM-Ⅲ型)；恒溫培養箱(英國，SPX-250B型)；恒溫孵育器(杭州奧盛儀器有限公司，K-20型)；漩渦振蕩器(天津津立儀器設備科技發展有限公司，TM60-4型)；PCR工作臺(上海市金鵬科技有限公司，BHC-1300II A/B3型)；AB-7500熒光定量PCR儀(北京新陽創業科技發展有限公司，7500型)；冰箱(容聲，BCD-295WYL型)；可見光分光光度計(上海上分計量檢測有限公司，722S型)。

1.3實驗方法

1.3.1 樣本采集

血清取樣：從小型豬前腔靜脈叢無菌采血5 mL，加入肝素抗凝管中，輕輕混勻，離心后分離血漿用于ELISA檢測，剩下血細胞用于DNA抽提。糞便：取豬新鮮糞便(含粘液)或肛拭子用于腸道病原菌和腸道寄生蟲檢測。體表拔毛取樣：用鑷子在耳根、頸后、眼周、背部、臀部和腹股溝等易感部位分別拔取少許被毛，散放于載玻片上，用透明膠帶壓住用于檢體外寄生蟲。取皮毛、鱗屑：用刮刀刮取動物皮毛、鱗屑接種于沙氏平板培養，用于皮膚病原真菌檢測。

1.3.2 檢測指標及方法

檢測指標共20項，包括病原菌指標7項，病毒指標9項和寄生蟲指標4項，具體檢測指標和方法見表2。ELISA、 PCR方法直接參照試劑盒說明書進行檢測，病原菌培養嚴格執行無菌操作。

1.4統計學方法

對檢測結果進行統計分析，非免疫群體以檢出率(陽性數量/樣本總量×100%)表示，免疫群體以免疫合格率(抗體陽性數量/樣本總量×100%)表示。

2 結果

2.1不同生產單位實驗用小型豬的病原檢測結果

本次調查結果見表2，不同生產單位實驗用小型豬的病原檢測結果存在差異。

在病原菌方面，4個生產單位都檢出豬鏈球菌2型和胸膜肺炎放線桿菌，感染率均較高，總體感染率達到50.7%和40.3%。豬肺炎支原體方面，A和C單位未檢測，B和D單位的檢出率為100%。4個生產單位均未檢出沙門氏菌、布魯氏菌、豬痢疾蛇樣螺旋體和皮膚病原真菌。

在病毒方面，年度國家動物疫病強制免疫計劃要求對豬瘟、口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征病毒進行免疫[11]。4家單位均未免疫豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗，但均能檢測到病毒感染，平均感染率達44.7%。A和B單位免疫了豬瘟病毒疫苗，A、B和C單位免疫了口蹄疫病毒疫苗，但免疫合格率低，未免疫的單位均未檢測到相應病毒抗體。B單位免疫了偽狂犬病毒疫苗，免疫率為98.4%，其他3家單位未免疫該病毒疫苗，但是均能檢測到不同比例的抗體。乙型腦炎病毒和豬圓環病毒2型4個生產單位皆有不同程度的感染，C單位豬圓環病毒2型感染率達100%。4家單位中，B和C單位檢測到豬細小病毒感染。4家單位中，只有B和D單位進行了豬傳染性胃腸炎的檢測，均有很高的檢出率。

在寄生蟲方面，所有4家單位均未檢出弓形蟲、體外寄生蟲和糞便球蟲，A、B、D單位檢出少量腸道蠕蟲。

2.2不同品系小型豬的病原免疫與感染情況

將檢測結果按小型豬品系進行分類統計(表3)，不同品系的小型豬病原免疫和感染情況總體差異不大。

疫苗免疫方面，只對豬瘟病毒、口蹄疫病毒和豬偽狂犬病病毒進行了免疫，豬偽狂犬病病毒免疫合格率最高，超過95%；口蹄疫病毒免疫合格率最低，均未超過60%；對于豬瘟病毒，只有巴馬小型豬免疫合格率達標。未免疫豬瘟病毒、口蹄疫病毒群體檢測結果為陰性，而未免疫豬偽狂犬病病毒群體有一定的檢出率。

群體病原感染方面，所有小型豬均未檢出沙門氏菌、布魯氏菌、豬痢疾蛇樣螺旋體、皮膚病原真菌、豬流感、弓形蟲、體外寄生蟲和糞便球蟲；所有受檢小型豬均檢測到豬鏈球菌2型、胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、乙型腦炎病毒、豬圓環病毒2型、豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。在腸道蠕蟲感染方面，有三個品系小型豬檢測到蟲體。

表2 不同生產單位的實驗用小型豬病原感染情況

注：*，為免疫群體的免疫合格率。

Note.*，indicats qualified rate of an immunized population.

表3 不同品系的實驗用小型豬的病原感染情況

注：*，為免疫群體的免疫合格率。

Note. *，indicates qualified rate in immunized population.

3 討論

微生物和寄生蟲感染實驗動物不僅會干擾試驗結果，影響動物生產，甚至還會威脅人類健康，因此需要定期開展病原監測[12]。本研究對廣東省保種繁育的實驗用小型豬開展了7種病原菌、9種病毒和4種寄生蟲的流行病學調查研究，結果發現各4種品系的小型豬均存在多種病原復合感染，不同品系的小型豬對病原的易感性總體差異不大。

現有關于實驗用小型豬流行病學調查研究結果顯示，不同地理區域、不同品系小型豬病原攜帶情況存在一定差異[7-10]。由于尚無關于廣東地區實驗用小型豬的流行病學調查報道，本研究可以彌補這方面的不足。本次調查結果顯示，豬鏈球菌2型、胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環病毒2型、乙型腦炎病毒、豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等主要病原流行特征與已有報道相似，只是存在感染率的差異；但廣東地區豬傳染性胃腸炎病毒檢出率高，甚至達到100%的感染率；廣東地區未檢出豬流感病毒(H1型)。本研究結果中實驗用小型豬肺炎支原體的檢出率與廣東地區商品豬肺炎支原體的調查結果相似[13]，表明豬種間病原的易感性差異不大，與地域性病原流行相關性高。

根據《2016年國家動物疫病強制免疫計劃》的要求，對高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性豬藍耳病、豬瘟，群體免疫密度應常年保持在90%以上，其中應免畜禽免疫密度應達到100%，免疫抗體合格率全年保持在70%以上[11]。而本調查結果，口蹄疫病毒(35.8%)，豬瘟病毒(62.8%)的免疫合格率都相對比較低，達不到免疫要求，部分生產單位未免疫或未及時免疫高危病原，存在較大風險。所有生產單位均未免疫豬繁殖與呼吸綜合征病毒，但所有品系均檢測到感染，表明小型豬對該病毒的易感性較高或感染后可檢測到抗體，與潘金春等[14]研究結果吻合。

本次調查結果顯示，廣東地區現有普通級實驗用小型豬存在多種病原復合感染并趨于復雜化，表明在普通級小型豬群體通過病原篩選高質量小型豬乃至SPF級小型豬的可行性不高，需要建立屏障環境生產繁育高等級小型豬。本研究結果對指導實驗用小型豬的生產、管理和使用有著重要的意義，同時可為小型豬質量控制標準的制/修訂提供基礎數據。

[1] Wakeman DR, Crain AM, Snyder EY. Large animal models are critical for rationally advancing regenerative therapies[J].Regen Med，2006, 1:405-413.

[2] Pan J, Min F, Wang X, et al. Establishment of a special pathogen free Chinese Wuzhishan minipigs colony [J].J AnimSci Technol，2015, 57:7.

[3] DB11/T 828.1-2011, 實驗用小型豬第1部分:微生物學等級及監測[S].

[4] DB11/T 828.2-2011, 實驗用小型豬第2部分:寄生蟲學等級及監測[S].

[5] DB31/T 240-2001, 實驗動物實驗用小型豬[S].

[6] DB45/T546-2008, 實驗動物小型豬[S].

[7] 胡燕, 楊欣艷, 王傳彬, 等.我國實驗用小型豬三個種群微生物感染狀況調查[J].中國比較醫學雜志, 2006,16(10): 599-602.

[8] 田維毅, 錢寧, 王平, 等.貴州小型豬病原生物攜帶和感染狀況的調查[J].實驗動物科學，2007,24(6):86-88.

[9] 楊欣艷, 胡燕, 王傳彬,等.國內不同地區實驗用小型豬種群微生物感染狀況調查[J].實驗動物科學, 2007,24(1):21-24.

[10] 王峰, 孫瑞萍, 劉濤, 等.海南封閉群五指山小型豬病原微生物攜帶狀況調查[J].江蘇農業科學,2012,40(7): 200-201.

[11] 2016年國家動物疫病強制免疫計劃[E].農醫發[2016]10號.

[12] 孫倩.實驗動物學基礎[M].北京：北京科學技術出版社.2005:97-129.

[13] 萬慶文, 謝王韻, 溫賢誠, 等.廣東東莞地區豬肺炎支原體感染的血清學調查[J].廣東畜牧獸醫科技.2014,39(3):22-23.

[14] 潘金春, 任柏樺, 閔凡貴, 等.不同品系小型豬對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的敏感性篩選[J].中國比較醫學雜志，2015,25(6):14-17.

MicrobiologicalandparasitologicalinvestigationofexperimentalminipigsinGuangdongprovince

HUANG Shu-wu1,2， MIN Fan-gui1,2， WU Rui-ke1,2， CHEN Mei-ling1,2， WANG Xi-long1,2*， PAN Jin-chun1,2*

(1.Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510663,China； 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663)

ObjectiveTo conduct a microbiological and parasitological investigation of experimental minipigs in Guangdong province.MethodsFour major experimental minipig production units in Guangdong province were included in this investigation. Samples were taken from a total of 154 pigs of 4 brreds, i.e., Bama minipigs, Juema minipigs, Tibet minipigs and Wuzhishan minipigs. Pig fur, scales, serum, rectal swabs and feces samples were collected for detection of 20 pathogens. The data were analyzed and compared among the production units and breeds.ResultsMixed infections were detected in all the four institutions. The infection rates of 7 pathogens were rather high:Streptococcussuistype 2 (50.7%),Actinobacilluspleuropneumoniae(40.3%),Mycoplasmahyopneumoniae(100%), Japanese encephalitis virus (41.3%), porcine circovirus type 2 (74.8%), porcine transmissible gastroenteritis virus (73.8%),gastroenteritis virus (44.7%).Porcine parvovirus (26.0%), pseudorabies virus(15.6%) and intestinal worms (3.2%) were also detected in some animals. The immune qualified rates of classical swine fever virus (62.8%) and foot-and-mouth disease virus (35.8%) were rather low. The immune qualified rate of pseudorabies virus was as high as 98.4%. Besides,Salmonella,Brucella, swine dysentery snake like spirochetes, dermatophytes, influenza virus. Toxoplasma gondii, ectoparasites, and coccidia were not detected.ConclusionsThe results of this investigation indicate that epidemiological quality control of pathogens in experimental minipigs and efforts to establish high grade minipig population in Guangdong province remain to be strengthened. Our study also provides a basis for revision of local and even national standards for experimental minipigs.

Experimental minipigs; Pathogenic bacteria; Virus; Parasite; Investigation

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0069-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.014

2017-03-21

廣東省科技計劃項目(2015A030302028，2015A030303004)。

黃樹武(1990-)，男，學士，研究方向：實驗動物質量監測和病原菌研究。E-mail: hsw2015@gdlami.com

王希龍(1963-)，男，研究員，研究方向：小型豬實驗動物標準化和比較醫學研究。E-mail: wangxilonggd@163.com。

潘金春(1979-)，男，副研究員，研究方向：實驗動物質量監測和比較醫學研究。E-mail: jcpan@sina.com。*共同通訊