內質網應激在三氧化二砷抑制HL-60增殖過程中的效應機制

張閃閃，李天一，王曉琴，張 波,2

(1. 石河子大學藥學院，2. 新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002)

內質網應激在三氧化二砷抑制HL-60增殖過程中的效應機制

張閃閃1，李天一1，王曉琴1，張 波1,2

(1. 石河子大學藥學院，2. 新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002)

目的探究三氧化二砷(ATO)引起內質網應激的效應機制，為掌控急性早幼粒白血病治療藥物監測提供間接藥理學指標。方法通過ATO的毒理學數據庫關聯基因數據整理建立蛋白-蛋白互作網絡，使用MCODE算法對網絡拓撲關系聚類分析尋找關聯基因群；采用HL-60細胞模型進行實驗研究。MTT法評價ATO對HL-60的細胞毒活性；Real-time PCR法檢測細胞內質網應激相關基因表達變化；Western blot檢測內質網應激相關蛋白表達水平；用ER-Tracker Red對內質網進行特異性熒光染色；流式細胞技術檢測細胞分化及凋亡指標變化。結果ATO相關的206個基因PPI網絡中有3 794對關系，排名前4的基因群中內質網應激模塊凸顯；ATO能抑制HL-60細胞增殖，并呈濃度依賴性；ATO在給藥4 h即可引起細胞內質網應激，GRP78和GRP94表達較明顯，隨著時間延長基因表達水平變化明顯，1～4 μmol·L-1引起GRP78、GRP94和Nrf2表達，8 μmol·L-1引起CHOP大量表達。ATO在1、2 μmol·L-1時引起eIF2α蛋白磷酸化水平增加，在8 μmol·L-1時誘導CHOP蛋白大量表達；內質網染色結果顯示，4、8 μmol·L-1的ATO誘導內質網的腫脹；流式結果表明ATO在1 μmol·L-1時引起細胞分化，在2 μmol·L-1時出現明顯分化群，4、8 μmol·L-1時細胞分化同樣明顯，但在8 μmol·L-1時細胞同時出現凋亡群。結論ATO抑制HL-60細胞增殖過程中出現內質網應激，并呈濃度依賴性階段性切換效應。

急性早幼粒細胞白血病；三氧化二砷；內質網應激；分化；凋亡；MCODE算法

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種以增殖/分化解偶聯異常為特征的疾病。砷劑作為白血病治療藥物，其臨床有效性已經得到公認，但毒性反應及耐藥性等問題也不容忽視。臨床靜脈給藥劑量5～10 mg·d-1，會引起白細胞增多、胃腸功能紊亂和呼吸困難，嚴重時會導致分化綜合征和心電圖異常[1-2]。在治療過程中，經常會因為療效而忽視藥物毒性所帶來的不良作用，在療效與毒性之間是否存在臨界濃度是值得思考的問題。

三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)可通過3種主要機制作用于AML細胞，包括誘導分化和(或)凋亡、生長抑制和血管生成抑制。其中誘導分化或凋亡是最為常見兩種藥效，二者在濃度、時間上呈現量質關系依賴，而對于何種機制引起的藥效切換少有關注。

細胞存活很大程度上取決于蛋白質的正確產生、控制和折疊。為了保持細胞內蛋白質穩態和應激刺激積累導致的內質網應激，細胞主要依賴于未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)的細胞保護網絡[3]，但當應激過強時，誘導細胞凋亡。因此，內質網應激可能作為細胞分化向凋亡切換的效應機制存在。因此，本文擬以急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)HL-60細胞為模型，同時基于毒理學數據庫的比較基因組學方法(comparative toxicogenomics database，CTD)，尋找關鍵基因群，研究ATO抑制HL-60細胞增殖過程中出現內質網應激并呈現濃度依賴性階段性切換效應，為白血病治療藥物監測提供間接藥理學指標。

1 材料

1.1細胞人早幼粒白血病HL-60細胞株，購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2藥物與試劑三氧化二砷(ATO，純度98%)，美國Sigma公司；胎牛血清，美國Biological Industries公司；IMDM細胞培養基，Gibco公司；MTT，北京索萊寶公司；Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司；PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1、FITC Mouse Anti-Human CD14，BD Biosciences公司；逆轉錄試劑盒，Thermo公司；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒、引物，上海生工生物工程有限公司；SYBR Green PCR kit，Qiagen公司；β-actin抗體，中杉金橋生物技術有限公司；BiP、CHOP、p-eIF2α、eIF2α和Histone H3抗體，Cell Signaling Technology；ER-Tracker Red試劑盒，碧云天生物公司。

1.3儀器CO2細胞培養箱(Thermo3131)，美國Thermo公司；超凈工作臺(ZHJH 1112B)，上海智誠分析儀器有限公司；正置熒光顯微鏡(ZEISS Imager. M2)，德國ZEISS公司；倒置生物顯微鏡(BDS200-PH)，重慶奧特光學儀器有限公司；多功能酶標儀(Thermo 3001)，美國Thermo公司；低溫離心機(5424)，德國Eppendorf公司；流式細胞儀(FACSCalibur)，美國BD公司。

2 方法

2.1細胞培養HL-60細胞用含20%胎牛血清、青霉素(終濃度100 kU·L-1)及鏈霉素(終濃度100 mg·L-1)的IMDM培養液(pH=7.5)在37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，取對數生長期細胞進行各項實驗。

2.2ATO相關基因篩選及分析從CTD數據庫[4](http://ctdbase.org/)獲得ATO相關基因3 259個，根據物種篩選出206個人類相關基因，對這些基因進行String(http://string-db.org/)分析，獲得基因互作關系，進而在Cytoscape(Version：3.2.0)中做出蛋白互作網絡圖，隨后運用MCODE算法[5]分析網絡子模塊。MCODE算法是一種基于密度的非交疊式聚類算法。該算法以種子節點為中心進行擴展，在其鄰居節點中尋找滿足要求的節點，從而形成一個功能模塊。

2.3細胞抑制率的測定96孔培養板上每孔接種4×104個細胞，培養液體積為200 μL，分別加入不同濃度的ATO，藥物終濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1，每組設6個復孔，37℃培養24 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，繼續培養4 h，1 000 r·min-1離心10 min棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀檢測570 nm處每孔的吸光度(OD)值，按下式公示計算細胞增殖抑制率[6]：

2.4Real-timePCR檢測細胞內質網應激相關基因的表達分別用ATO(0、1、2、4、8 μmol·L-1)處理細胞4、8、24 h。使用UNIQ 10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒提取RNA，檢測定量RNA水平及含量，并用TaKaRa逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。Real-time PCR檢測系統條件為：95℃ 15 s；60℃ 45 s；45個循環[7]。引物序列見Tab 1。

2.5Westernblot法檢測蛋白表達收集ATO各處理組(0、1、2、4、8 μmol·L-1)細胞，4℃預冷的PBS洗2遍，加入200 μL RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清。蛋白經煮沸處理后，各組取30 μg蛋白樣品，經10% SDS PAGE電泳分離，轉印PVDF膜，加入一抗，4℃過夜，次日以TBST洗膜4次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h；以TBST洗膜4次，每次5 min，加入ECL顯色液，經免疫印跡成像系統顯影檢測目的蛋白[8]。

Tab 1 Primer sequence

Tab 2 MCODE scoring for PPI network

2.6內質網特異性熒光染色收集ATO各處理組(0、2、4、8 μmol·L-1)細胞，用PBS洗滌細胞，離心去除洗滌液，加入配制好并37℃預溫育的ER-Tracker Red染色工作液(稀釋比例為1 ∶1 000)，與細胞37℃共孵育15～30 min。去除ER-Tracker Red染色工作液，用PBS洗滌細胞1～2次，用熒光顯微鏡進行觀察[9]。

2.7流式細胞技術檢測細胞分化率取對數期HL-60細胞，調整細胞密度為5×108·L-1，分別加入不同濃度的ATO，藥物終濃度分別為0、1、2、4、8 μmol·L-1，孵育72 h后收集細胞，用冷PBS洗2次，加100 μL鞘液將細胞懸起，依次加入20 μL CD11b、CD14熒光抗體，混勻，室溫、避光、反應20 min。300×g離心5 min棄上清，每管加入1 mL鞘液將細胞懸起，300×g離心5 min棄上清，加0.5 mL鞘液混勻，4℃避光，1 h內進行流式細胞儀檢測，用CELL Quest Pro軟件分析數據[10]。

2.8流式細胞儀檢測細胞凋亡率取對數期HL-60細胞，調整細胞密度為5 ×108·L-1，分別加入不同濃度的ATO，藥物終濃度分別為0、1、2、4、8 μmol·L-1，孵育48 h后收集細胞，用冷PBS洗2次，加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，分別加入5 μL Annexin V和PI，混勻，室溫、避光、反應5～15 min，1 h內進行流式細胞儀檢測，用CELL Quest Pro軟件分析數據[11]。

3 結果

3.1MCODE算法對網絡拓撲關系聚類分析將蛋白互作網絡進行MCODE分析，結果見Tab 2。該算法優于其他圖形聚類方法，既可以對感興趣的聚類進行定向的微調而不考慮網絡中的其余部分，又允許檢查與蛋白質網絡相關的聚類互連性。其核心思想是以局部密度所定義的adhoc網絡為根據，分離局部稠密區域。共有6個集群被提取出來，并給出了相應的分數。我們對每個集群進行功能聚類，發現前兩個集群中的基因與凋亡、增殖和分化密切相關[1,12](Fig 1)。PML、RARA、CEBPB、HMOX1與APL細胞的分化相關，CASP3、BCL2、BCL2L1與APL細胞凋亡相關，MAPK8、CDK1、MAPK1、MAPK9、MAPK14與APL細胞增殖相關。第3個集群中的基因全部與內質網相關(Fig 1)，ATF6、NFE2L2、ATF4、XBP1是內質網應激通路上的重要基因，在前兩個集群中同樣存在重要的內質網應激基因，如EIF2AK3和EIF4E。

Fig 1 Protein-protein interaction networkof ATO and three MCODE modules

A:ATO all related genes;B:The first cluster, score was 45.051;C:The second cluster, score was 8.762;D:The third cluster, score was 4

3.2ATO抑制HL-60細胞增殖ATO對HL-60細胞24 h半數抑制濃度(IC50)為14.8 μmol·L-1，抑制作用隨ATO濃度增加而增強，呈現一定的量效關系(Fig 2)。ATO濃度為10 μmol·L-1時，對HL-60細胞的抑制率為33.9%，大于此濃度時抑制率呈快速上升趨勢?；诒緦嶒?，研究后續選擇ATO 10 μmol·L-1以下的較小濃度。

Fig 2 Inhibitory rate of ATO on HL-60cells after treatment of 24 h(±s,n=3)

**P<0.01vscontrol

3.3ATO對HL-60細胞內質網應激相關基因mRNA表達的影響不同濃度ATO處理HL-60細胞4 h時，GRP94有不同程度的上調，在1 μmol·L-1時上調比率較高。當作用時間延長至8 h時，GRP78和GRP94在ATO 2 μmol·L-1時上調明顯，而CHOP在ATO 4、5 μmol·L-1時上調明顯。在24 h時，GRP78在ATO 4 μmol·L-1時上調明顯，而CHOP在ATO 8 μmol·L-1時上調明顯。Nrf2在處理4 h時上調明顯，8、24 h時也有上調，但上調倍率不及4 h，且都在較低濃度時上調明顯(Fig 3)。

Fig 3 Changes of GRP78, GRP94, CHOP and Nrf2 mRNAexpression levels after ATO treatment at different concentrations and time assessed by real-time PCR(±s,n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.4ATO對HL-60細胞內質網應激相關基因蛋白表達的影響ATO處理HL-60細胞24 h時，GRP78在ATO 4 μmol·L-1時上調最為明顯，p-eIF2α在ATO 1、2 μmol·L-1時上調明顯，CHOP在ATO 8 μmol·L-1時上調明顯(Fig 4)。

3.5ATO引起內質網腫脹的量效關系由Fig 5可知，空白組細胞的內質網形態正常，熒光分布在細胞外圍。2 μmol·L-1的ATO處理細胞后可見內質網的輕微腫脹，導致細胞中心熒光強度增加，ATO 4 μmol·L-1可見內質網管腔的異常擴張和腫脹，導致整個細胞充滿熒光，或可見內質網聚集，呈小的堆疊塊狀。ATO 8 μmol·L-1時同時可見細胞形態的改變。

3.6ATO對HL-60細胞分化影響的量效關系

Fig 4 Changes of GRP78, p-eIF2αand CHOP protein expression levels after ATO treatment atdifferent concentrations assessed by Western blot(±s，n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 5 The morphological changeof endoplasmic reticulum in HL-60 cells afterATO treatment by fluorescence microscope(×100)

A:ATO 0 μmol·L-1;B:ATO 2 μmol·L-1;C:ATO 4 μmol·L-1;D:ATO 8 μmol·L-1

由Fig 6可知，1 μmol·L-1的ATO處理細胞72 h后分化已經發生，在ATO 2 μmol·L-1時CD11b的表達上升明顯，且出現明顯分群，其各特征細胞群聚集程度高。ATO 4、8 μmol·L-1時CD11b表達同樣明顯。

3.7ATO對HL-60細胞凋亡影響的量效關系由Fig 7可知，ATO誘導HL-60細胞凋亡呈藥物濃度依賴性變化。8 μmol·L-1的ATO處理細胞48 h后，凋亡率較空白組上升最為明顯。

4 討論

APL是造血組織的惡性疾病，其特征是形態異常的早幼粒細胞增生。ATO作為治療APL的臨床有效藥，治療窗窄，尋找藥效學臨界點的藥理學依據對于控制不良反應的發生有重要價值。

UPR是一種促生存反應，減少未折疊蛋白的積累并恢復正常的內質網功能。蛋白質持續聚集則信號從促存活轉換到促凋亡。早期內質網應激會經PERK作用使位于內質網外側的eIF2α蛋白磷酸化，抑制蛋白合成，促使ATF4的翻譯能夠通過替代性eIF2α非依賴性翻譯途徑發生。ATF4轉位到細胞核，誘導ER體內平衡所需的基因轉錄。減輕了內質網新生肽鏈折疊的負荷，但這只是一種臨時性的防御措施。經較長時間應激后，內質網應激蛋白如GRP78、GRP94、ATF4等表達增加，提高細胞處理未折疊蛋白能力。研究發現，磷酸化eIF2α蛋白與內質網應激中期應激蛋白的表達和蛋白質合成啟動的恢復也有關系。PERK的激活也誘導CHOP的產生，是從促存活轉為致死信號的重要因素，最終導致細胞凋亡的發生[3]。

由MCODE算法對ATO相關基因網絡拓撲關系聚類結果分析可知，內質網應激相關基因在其中占據較高比重。EIF2AK3、EIF4E、XBP1、ATF6、NFE2L2、 ATF4是內質網應激3條通路上的基因，與內質網應激密切相關。第3模塊中的基因全部與內質網相關，提示這些基因可能是關鍵功能基因群，而內質網應激是細胞分化向凋亡切換的效應機制。

Fig 6 The differentiation level of HL-60 cells detected by flow cytometry at different concentrations of ATO(±s,n=3)

A: ATO 0 μmol·L-1; B: ATO 1 μmol·L-1; C: ATO 2 μmol·L-1; D: ATO 4 μmol·L-1; E: ATO 8 μmol·L-1; F: Cell differentiation rate; G: CD11b and CD14 fluorescence intensity.**P<0.01vscontrol

A: ATO 0 μmol·L-1; B: ATO 1 μmol·L-1; C: ATO 2 μmol·L-1; D: ATO 4 μmol·L-1; E: ATO 8 μmol·L-1; F: Cell apoptosis rate.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Chen等[13]發現ATO作用于NB4細胞24、72、120 h時，較高濃度(0.5～2 μmol·L-1)先誘導凋亡，低濃度誘導(0.1～0.5 μmol·L-1)部分分化，且PML-RARα蛋白的快速調節和降解可能有助于這兩種效應。Luesink等[14]研究發現，1 μmol·L-1的ATO作用于NB4細胞72 h時，可見Annexin V和PI的雙陽性，同時CD11b表達略有增加，當ATO和ATRA聯合用藥時，可以觀察到明顯的分化和凋亡雙誘導。Chen等[15]研究發現，ATO作用于NB4細胞48 h時，高濃度(1～2 μmol·L-1)通過激活線粒體介導的內在凋亡途徑誘導凋亡，并促進低濃度細胞分化(0.25～0.5 μmol·L-1)。這些研究均證明ATO對APL細胞確實具有劑量依賴性雙重作用：在低濃度下誘導分化，在高濃度下引發細胞凋亡并誘導部分分化。但這些研究都局限于NB4細胞，且藥物作用時間較長，未能清楚闡明ATO誘導細胞分化和凋亡雙重作用的機制，以及分化向凋亡切換效應所涉及到的基因表達的改變。

本研究結果表明，在1～2 μmol·L-1時p-eIF2α蛋白高表達，而CHOP蛋白表達低，說明在此濃度下只引起了輕微的內質網應激，且在該濃度下，細胞分化事件發生，特別是在2 μmol·L-1時，細胞出現了明顯的分群，而凋亡事件并未發生。在8 μmol·L-1時，p-eIF2α蛋白低表達，CHOP蛋白高表達，此時細胞出現了明顯的凋亡，同時分化事件依然存在。在mRNA水平，本文揭示了分化和內質網應激事件的時效關系，由結果可知，分化發生在內質網應激事件之后，這說明細胞分化、凋亡事件的發生，分化、凋亡切換效應均與細胞內質網應激密切相關。因此，內質網應激確實是ATO化療中臨界的一個標志，對于毒性預警和治療極量具有把控價值。更深入的機制仍有待進一步研究。

(致謝:本研究在石河子大學藥學院新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室完成，感謝在本課題研究中給予幫助和支持的同學。)

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MechanismofERstressinvolvedinATOinhibitedHL-60proliferation

ZHANG Shan-shan1, LI Tian-yi1, WANG Xiao-qin1, ZHANG Bo1,2

(1.SchoolofPharmaceutics,ShiheziUniversity; 2.KeyLabofXinjiangPlantResourcesandUtilization,MinistryofEducation,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832002,China)

AimTo explore the pharmacological mechanism of arsenic trioxide(ATO) on endoplasmic reticulum(ER) stress and provide indirect pharmacological indicators for the therapeutic drugs monitoring of acute promyelocytic leukemia.MethodsThe ATO toxicology database was utilized to associate gene data and establish protein-protein interaction networks. MCODE algorithm was used to analyze clustering of network topology relationship in order to find the critical functional gene group. The HL-60 cells were used as the model in this study. The cytotoxicity of ATO to HL-60 was evaluated by MTT assay. Real-time PCR assay was involved in detecting the expression of stress-related genes in ER stress. Western blot was used to detect the expression of stress-related proteins in ER stress. ER-specific staining was conducted by ER-Tracker Red. Cell differentiation and apoptosis was tested by flow cytometry.Results206 ATO-related genes had 3 794 pairs of relationships, and ER stress-related module was outstanding among the top 4 gene cluster. ATO inhibited HL-60 cell proliferation in a dose-dependent manner; 4 h after administration ATO could induce ER stress. The expressions of GRP78 and GRP94 were significant and the gene expression level changed greatly over time. The expression level of GRP78, GRP94 and Nrf2 was induced by 1～4 μmol·L-1ATO, and the expression of CHOP was significant by 8 μmol·L-1ATO. ATO could induce the phosphorylation level of eIF2α protein at 1～2 μmol·L-1as well as a large expression of CHOP protein markedly at 8 μmol·L-1. As shown in ER-specific staining, ATO at 4, 8 μmol·L-1induced ER swelling. Flow cytometry showed that ATO could induce cell differentiation at 1 μmol·L-1, and the differentiation group was obvious at 2 μmol·L-1. So as to the concentration of 4 and 8 μmol·L-1, but the apoptotic group emerged at 8 μmol·L-1.ConclusionATO can inhibit the proliferation of HL-60 and in this process, ER stress is involved, which shows a concentration-dependent phase-switching effect.

acute promyelocytic leukemia; arsenic trioxide; ER stress; differentiation; apoptosis; MCODE algorithm

A

1001-1978(2017)11-1589-07

R329.24；R733.710.22；R979.1

時間：2017-10-10 10:05 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.044.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.022

2017-07-18,

2017-08-22

國家自然科學基金資助項目(No 81460566，U1603122)

張閃閃(1992-)，女，碩士生，研究方向：系統藥理學與分子藥理學，E-mail：1520813826@qq.com； 張 波(1978-)，男，博士，教授，研究方向：系統藥理學與中藥藥理學，通訊作者，E-mail：bozhang_lzu@126.com