木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶的可及性測定方法研究進展

吳琳梅，丁 銳，薛紹禮，夏覓真

(安徽醫(yī)科大學生命科學學院，安徽 合肥 230032)

木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶的可及性測定方法研究進展

吳琳梅，丁 銳，薛紹禮，夏覓真*

(安徽醫(yī)科大學生命科學學院，安徽 合肥 230032)

木質(zhì)纖維生物質(zhì)通過酶解轉(zhuǎn)化成乙醇燃料和化工產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景，但木質(zhì)纖維生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成復(fù)雜，阻礙了其活性位點與纖維素酶的結(jié)合，不利于酶解的進行。對木質(zhì)纖維生物質(zhì)進行預(yù)處理，可以改善其結(jié)構(gòu)，提高其對纖維素酶的可及性，從而提高酶解效率。重點概述了西蒙染色法、溶質(zhì)排阻法、蛋白質(zhì)吸附法等可及性測定方法,分析比較了各方法的優(yōu)缺點,并對可及性測定方法的研究方向進行了展望。

木質(zhì)纖維生物質(zhì)；纖維素酶；可及性；酶解；預(yù)處理

木質(zhì)纖維生物質(zhì)占地球植物生物質(zhì)的90%以上，是豐富的可再生資源。利用纖維素酶將木質(zhì)纖維生物質(zhì)降解成可發(fā)酵單糖，然后發(fā)酵生產(chǎn)液體燃料及化工產(chǎn)品，對于解決能源危機、環(huán)境污染等難題有著非常重要的意義[1-2]。但是，酶解效率低限制了木質(zhì)纖維生物質(zhì)的有效利用，而木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶的可及性低是造成酶解效率低的重要原因[3-4]。可及性是指單位量的木質(zhì)纖維生物質(zhì)中可以與纖維素酶結(jié)合且能夠被酶降解或微生物利用的結(jié)合位點量。一般而言，只有當木質(zhì)纖維生物質(zhì)表面位點與纖維素酶接觸、吸附結(jié)合后，才有可能進一步被酶降解成可發(fā)酵單糖，因此，可及性是基于酶解的生物處理中最根本的限制因素[3]。然而，木質(zhì)纖維生物質(zhì)細胞壁微觀結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、主要組分(木質(zhì)素、半纖維素及纖維素)分布的不均一性以及纖維素的超分子結(jié)構(gòu)形成了天然的抗降解屏障，阻礙了纖維素酶與木質(zhì)纖維生物質(zhì)的結(jié)合，不利于酶解，因此，木質(zhì)纖維生物質(zhì)在酶解前要進行預(yù)處理，破壞生物質(zhì)細胞壁抗降解屏障[5]。

目前，關(guān)于木質(zhì)纖維生物質(zhì)預(yù)處理的研究報道較多[6-7]。雖然預(yù)處理的方法和手段不盡相同，但主要目的一致，即除去木質(zhì)纖維生物質(zhì)中的木質(zhì)素與半纖維素、降低纖維素的結(jié)晶度和聚合度、增大纖維素的表面積和孔隙率等，使得木質(zhì)纖維生物質(zhì)具有適宜的結(jié)構(gòu)特征，提高其對纖維素酶的可及性，從而提高酶解效率。可及性作為評價木質(zhì)纖維生物質(zhì)預(yù)處理效果的重要依據(jù)，為不同木質(zhì)纖維生物質(zhì)的預(yù)處理方法選擇提供了理論指導。但采用不同方法測定的可及性有所差異，而國內(nèi)外至今還沒有統(tǒng)一的可及性測定方法和標準。鑒于此，作者從原理、應(yīng)用等方面對可及性測定方法進行簡述，以期為木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶可及性測定方法的深入研究提供參考。

1 間接法測定可及性

間接測定法與木質(zhì)纖維生物質(zhì)的孔道結(jié)構(gòu)(孔徑、孔隙率、孔形貌)和內(nèi)表面積有關(guān)。植物細胞壁孔徑太小(5～10 nm)，阻礙酶擴散，孔徑應(yīng)當至少在50～100 nm范圍內(nèi)酶才能夠充分地擴散[8]。孔道結(jié)構(gòu)的測定方法能夠作為可及性的間接評價方法，其中，常用的保水值法和BET法因水和氮氣分子的直徑遠小于纖維素酶，誤差較大；而西蒙染色法(Simons′ stain)和溶質(zhì)排阻法(solute exclusion)在一定程度上彌補了上述缺陷。

1.1 西蒙染色法

西蒙染色法是一種簡單易行的可及性半定量測定方法，主要通過直接藍1(direct blue 1 dye，CI constitution No.24410)和直接橙15(direct orange 15 dye，CI constitution No.40002/3)這2種染料在木質(zhì)纖維生物質(zhì)上的競爭吸附來評價木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶的可及性[9]。直接藍1分子尺寸小(直徑約1 nm)、對纖維素的親和力弱，而直接橙15分子尺寸大(直徑5～36 nm)、對纖維素有很強的親和力[9]。當這2種染料分子共同作用于纖維素時，親和力強的直接橙15大分子優(yōu)先吸附在大孔中，并將大孔中已吸附的直接藍1替換出來，致使直接藍1只能吸附在纖維素的小孔中。因此，直接藍1與直接橙15的吸附量能指示纖維素結(jié)構(gòu)中大孔與小孔的量。同時，由于直接橙15的分子尺寸與內(nèi)切葡聚糖酶的催化中心大小相似，所以其吸附量也常用作木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶可及性的評價指標。

A455=εO/455LcO+εB/455LcB

(1)

A624=εO/624LcO+εB/624LcB

(2)

(3)

式中：A455、A624分別為溶液在455 nm、624 nm處的吸光度；εO/455、εO/624分別為直接橙15在455 nm、624 nm下的消光系數(shù)；εB/455、εB/624分別為直接藍1在455 nm、624 nm下的消光系數(shù)；L為比色皿內(nèi)徑；cO為直接橙15的濃度；cB為直接藍1的濃度；q為吸附量；Kads為吸附平衡常數(shù)。

Chandra等[10-11]研究蒸汽處理、乙醇-有機溶劑處理、熱處理等預(yù)處理方法對木質(zhì)纖維生物質(zhì)酶解效率及染料吸附量的影響時發(fā)現(xiàn)，乙醇-有機溶劑處理時的酶解效率最高、染料吸附量最大。因此，可以用B+O值表征可及性，B+O值增大時，可及性提高。此外，Arantes等[12]研究發(fā)現(xiàn)，可及性提高時O/B值也隨之增大，水解底物所需酶量相應(yīng)減少。

Meng等[13]通過西蒙染色法比較了稀酸處理和蒸汽爆破處理前后楊屬生物質(zhì)的孔道結(jié)構(gòu)變化，從而研究預(yù)處理對可及性的影響。結(jié)果表明，楊屬生物質(zhì)未處理前B+O值為67.0 mg·g-1、O/B值為0.19；蒸汽爆破10 min后，B+O值為80.7 mg·g-1、O/B值為0.25；稀酸處理10 min后，B+O值為100.1 mg·g-1、O/B值為0.39。相對于蒸汽爆破，稀酸處理的B+O值與O/B值均較高，說明稀酸處理能有效提高楊屬生物質(zhì)對纖維素酶的可及性。

1.2 溶質(zhì)排阻法

溶質(zhì)排阻法：木質(zhì)纖維生物質(zhì)在不同尺寸的探針分子溶液中發(fā)生溶脹，部分水分子和溶質(zhì)探針分子進入孔道結(jié)構(gòu)中，導致溶質(zhì)濃度發(fā)生改變，通過測定孔體積或內(nèi)表面積來評價木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶的可及性。探針分子必須滿足以下條件：不與木質(zhì)纖維生物質(zhì)發(fā)生相互作用、非電解質(zhì)、分子量分布窄、在溶液中呈球形等[14]。葡聚糖(dextran)與聚乙二醇(PEG)為常用的探針分子，其平均分子量及分子直徑見表 1。

表1探針分子的平均分子量與分子直徑

Tab.1Average molecular weight and molecular

西蒙染色法與溶質(zhì)排阻法均是基于對木質(zhì)纖維生物質(zhì)的孔道結(jié)構(gòu)表征來評價可及性。區(qū)別在于：西蒙染色法是基于預(yù)處理前后孔數(shù)量變化(B+O值作為依據(jù))及大孔與小孔所占比例的變化(O/B值作為依據(jù))來評價可及性；而溶質(zhì)排阻法是基于孔體積及內(nèi)表面積的變化來評價可及性。木質(zhì)纖維生物質(zhì)具有外表面積與內(nèi)表面積，外表面積主要與木質(zhì)纖維生物質(zhì)的顆粒大小有關(guān)，內(nèi)表面積與孔壁面積有關(guān)。研究表明，90%的酶解效率由底物中酶可及的內(nèi)表面積(孔壁面積)貢獻[15]。因此，木質(zhì)纖維生物質(zhì)的內(nèi)表面積是評價可及性的另一重要指標。

目前，溶質(zhì)排阻法沒有統(tǒng)一的操作標準，但測定流程相似：將一定量的木質(zhì)纖維生物質(zhì)置于一定尺寸的探針分子溶液(葡聚糖或聚乙二醇溶液)中進行膨脹處理，靜置一段時間后取上清液，離心，用HPLC法測定上清液中溶質(zhì)的濃度。溶質(zhì)排阻法的關(guān)鍵是利用溶質(zhì)濃度的變化計算孔體積及內(nèi)表面積。溶質(zhì)濃度的變化滿足質(zhì)量守恒定律[16]：

(4)

式中：δi為以分子直徑為i的探針分子為溶質(zhì)時單位木質(zhì)纖維生物質(zhì)孔道中可及水分子的質(zhì)量，g·g-1；w為溶質(zhì)溶液的初始質(zhì)量，g；q為木質(zhì)纖維生物質(zhì)所含水的質(zhì)量，g；P為木質(zhì)纖維生物質(zhì)的干量，g；c0與c分別為溶質(zhì)初始濃度與離心后上清液中溶質(zhì)的濃度，%。

水的密度以1 g·mL-1計，則δi=Vi(水分子所占據(jù)的孔道體積)。因此，分子直徑為i的溶質(zhì)分子所占據(jù)的孔道體積Va=Vall-Vi(式中Vall為孔道總體積)。若以聚乙二醇為探針分子，則Vall等于以平均分子量在3 350～10 000之間的聚乙二醇探針分子所計算出的Vi平均值[17]；若以葡聚糖為探針分子，Vall等于以分子直徑為560 ?的葡聚糖分子dextran T2000所計算出的Vi值。因為，dextran T2000探針分子的尺寸最大(560 ?)，很難進入木質(zhì)纖維生物質(zhì)的孔道結(jié)構(gòu)中，孔道可全部被水分子占據(jù)，所以Vall=Vi[18]。若假設(shè)所有的孔洞都是圓柱形，分子直徑為m的探針分子對木質(zhì)纖維生物質(zhì)的可及孔面積(accessible pore surface，CAPm)可表示為[18]：

(5)

已知纖維素酶的分子直徑約為51 ?[19]，若利用分子直徑相當?shù)钠暇厶亲鳛樘綔y分子，可以較為準確地表征木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶的可及孔面積和孔體積。

Wang等[18]以葡聚糖為探針分子，通過溶質(zhì)排阻法研究了稀酸(DA)處理及不同pH值下亞硫酸鹽(SPORL)處理對黑松的孔徑分布及酶解效率的影響。結(jié)果表明，與未經(jīng)處理和稀酸處理相比，亞硫酸鹽處理的底物在51～200 ?范圍內(nèi)含有更多的孔洞(圖 1[20])，促進了酶解效率的提升，說明亞硫酸鹽處理可顯著提高黑松對纖維素酶的可及性。

圖1 不同預(yù)處理法制備的底物的孔徑分布Fig.1 Pore size distribution of substrates prepared bydifferent pretreatment methods

Meunier-Goddik等[21]利用溶質(zhì)排阻法研究了稀酸處理(0.6% H2SO4，10 min，180 ℃)對楊木的酶可及表面積的影響，結(jié)果與Wang等[18]相似，未處理楊木的酶可及表面積為36 m2·g-1，稀酸處理后其酶可及表面積增大到115 m2·g-1，纖維素轉(zhuǎn)化率由8%升高到78%。Duan等[22]利用溶質(zhì)排阻法研究了干燥過程對硬木溶解紙漿的可及表面積及纖維素酶吸附量的影響，結(jié)果表明，未干燥紙漿的可及表面積為21.6 m2·g-1，105 ℃下干燥4 h后紙漿的可及表面積縮小到4.3 m2·g-1，纖維素酶吸附量也相應(yīng)減少。

2 直接法測定可及性

直接法測定可及性與間接法的區(qū)別在于：間接法是利用染料分子(直接藍1和直接橙15)的吸附或者溶質(zhì)分子(葡聚糖或聚乙二醇)濃度的變化來表征底物孔道結(jié)構(gòu)(孔道數(shù)量、孔體積、內(nèi)表面積)的變化，從而評價可及性；而直接法是基于纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose binding module,CBM)與底物的相互作用來評價可及性。自然界中纖維素酶種類繁多，大多是由相對獨立的2種結(jié)構(gòu)域組成：催化結(jié)構(gòu)域(CD)和CBM。通過CBM與木質(zhì)纖維生物質(zhì)的吸附作用增強不溶性纖維素對纖維素酶的可及性，擴大底物附近的酶濃度，最終提高酶解效率。一般而言，不直接采用吸附纖維素酶的方法來測定可及性。因為，為了防止纖維素酶水解底物，吸附實驗通常在低溫(4 ℃)下進行，但低溫下的纖維素酶的吸附特性與水解溫度下的吸附特性相差甚遠，因此，可構(gòu)造含有CBM的非水解蛋白，并以其為探針分子，通過計算底物對蛋白質(zhì)探針分子的吸附量來評價可及性。

Hong等[23]利用融合技術(shù)構(gòu)造出含有3個CBM和綠色熒光蛋白(GFP)的非水解融合蛋白TGC，其分子直徑與纖維素酶分子直徑相近，通過酶標儀檢測溶液中木質(zhì)纖維素底物未吸附的TGC濃度，并通過Langmuir方程計算出TGC的最大吸附量，從而評價纖維素酶的可及性(CAC,m2·g-1)。可及性的計算滿足以下關(guān)系式：

CAC=αWmaxNAAG2/(106×S)

(6)

式中：α為纖維素晶面上吸附TGC分子的數(shù)量；Wmax為TGC分子的最大吸附量，μmol·L-1；NA為阿伏伽德羅常數(shù)；AG2為纖維素110晶面的面積，5.512×10-19m2；S為木質(zhì)纖維素的濃度，g·L-1。

Hong等測定的再生無定形纖維素的CAC值為41.9 m2·g-1；細菌微晶纖維素的CAC值為33.5 m2·g-1，Whatman 1號濾紙的CAC值為9.76 m2·g-1，Avicel的CAC值為2.38 m2·g-1。

何品晶等[24]發(fā)明了一種可視化的、原位測定木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶可及性的方法：以纖維小體熒光蛋白為探針分子，通過熒光光度計計算單位面積吸附探針分子的量，并用熒光顯微鏡原位觀測和計數(shù)木質(zhì)纖維生物質(zhì)樣品上熒光標記的酶結(jié)合位點來評價可及性。纖維小體熒光蛋白探針是一種采用熒光蛋白標記的纖維小體片段，其蛋白序列包括2部分，一端是來自于微生物纖維小體的纖維素結(jié)合模塊蛋白，另一端是熒光蛋白。木質(zhì)纖維生物質(zhì)的酶結(jié)合總位點包括不可降解的酶結(jié)合位點(纖維素酶與生物質(zhì)中的木質(zhì)素結(jié)合)和可降解的酶結(jié)合位點(纖維素酶與生物質(zhì)中的纖維素結(jié)合)。利用牛血清白蛋白封閉不可降解的酶結(jié)合位點，用纖維小體熒光蛋白探針標記可降解的酶結(jié)合位點。纖維素酶結(jié)合位點的平均熒光值占酶結(jié)合總位點平均熒光值的百分比越大，則可及性越強。

3 結(jié)語

近年來，關(guān)于預(yù)處理可提高木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶的可及性及酶解效率的觀點已經(jīng)得到了越來越多的證實。但目前關(guān)于可及性測定方法尚無統(tǒng)一標準。雖然，西蒙染色法、溶質(zhì)排阻法及蛋白質(zhì)吸附法等均可用于測定可及性，但每種方法都存在一定的局限性。西蒙染色法簡單快捷，但只能對可及性進行半定量測定，且測定過程中易受到孔形狀的影響；溶質(zhì)排阻法能夠?qū)杉靶赃M行定量測定，但只能對內(nèi)表面積測定，無法反映出外表面積變化情況，也易受孔形狀的影響；蛋白質(zhì)吸附法所用探針蛋白質(zhì)雖然存在纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域且分子大小與纖維素酶相似，但在測定過程中部分探針蛋白質(zhì)會與木質(zhì)素結(jié)合，造成測定誤差。不管采用何種測定方法，最終都要以實際反應(yīng)過程纖維素的酶解效率、生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率、還原性糖的產(chǎn)量等指標來驗證可及性的測定結(jié)果。隨著纖維素超分子結(jié)構(gòu)及纖維素酶催化機理的深入研究，近來發(fā)現(xiàn)纖維素酶的吸附與催化反應(yīng)發(fā)生在纖維素的疏水晶面。因此，基于對疏水晶面的數(shù)量和面積表征而建立起來的全新可及性測定方法還有待發(fā)展。

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ResearchProgressinDeterminationMethodsforAccessibilityofLignocellulosicBiomasstoCellulase

WU Lin-mei,DING Rui,XUE Shao-li,XIA Mi-zhen*

(CollegeofLifeSciences,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

The conversion of lignocellulosic biomass into ethanol fuels and chemical products through enzymolysis has a broad application prospect.However,the complicated structure and composition of lignocellulosic biomass prevent the combination of its active site and cellulase,and limit the enzymolysis.Pretreatment of lignocellulosic biomass can improve the structure,enhance the accessibility to cellulase,and thus improve enzymolysis efficiency.In this paper,we analyze and compare advantages and disadvantages of accessibility determination method(such as Simons′ stain,solute exclusion,and protein adsorption),and point out the direction for their research.

lignocellulosic biomass;cellulase;accessibility;enzymolysis;pretreatment

Q556 O629.8

A

1672-5425(2017)10-0001-05

安徽醫(yī)科大學博士科研基金項目(0807016101)

2017-04-24

吳琳梅(1988—)，女，貴州三都人，講師，研究方向：木質(zhì)纖維生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與利用，E-mail:wlm88.1.26@126.com；通訊作者：夏覓真，副教授，E-mail:xiamizhena@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.001

吳琳梅，丁銳，薛紹禮,等.木質(zhì)纖維生物質(zhì)對纖維素酶的可及性測定方法研究進展[J].化學與生物工程，2017，34(10)：1-5.