脂肽的自組裝特性及其與十二烷基麥芽糖苷的復配研究

李 泉，成 磊，于道永，徐 海

(中國石油大學(華東)化學工程學院 生物工程與技術中心，山東 青島 266580)

脂肽的自組裝特性及其與十二烷基麥芽糖苷的復配研究

李 泉，成 磊，于道永*，徐 海

(中國石油大學(華東)化學工程學院 生物工程與技術中心，山東 青島 266580)

以組氨酸和十二烷酸為原料，合成了3種脂肽C12HH-COOH、C12HH-CONH2和C12HHH-CONH2，該類脂肽分子結構中都包含十二烷酸疏水烷烴鏈及組氨酸親水肽鏈，具有傳統表面活性劑和肽表面活性劑的結構特點。表面張力分析表明，3種脂肽在水溶液中都具有明顯的表面活性劑特性，在MES緩沖溶液(20 mmol·L-1，pH=6.0)中的臨界膠束濃度分別為0.40 mmol·L-1、0.63 mmol·L-1、1.10 mmol·L-1；隨著緩沖溶液pH值的減小，脂肽親水頭基組氨酸側鏈的帶電性增強，臨界膠束濃度逐漸增大。3種脂肽都能與傳統表面活性劑十二烷基麥芽糖苷(DDM)復配自組裝形成混合膠束，且混合膠束的平均粒徑與復配體系中脂肽的含量有關。

脂肽；自組裝；表面活性劑；復配

生物小分子如多肽、核苷酸等生物材料具有良好的生物相容性、生物活性以及生物可降解性等諸多優點，受到眾多研究者的關注[1-4]。脂肽是一類烷基鏈與多肽片段通過酰胺鍵連接而成的多肽衍生物，結合了傳統表面活性劑分子和肽表面活性劑分子的結構特點，不僅具有兩親性，還具有自組裝特性。與傳統表面活性劑分子相比，脂肽分子自組裝的驅動力更豐富，可以在疏水作用、氫鍵作用、靜電作用、π-π堆積作用等非共價鍵力的協同作用下自組裝成各種納米結構(如纖維、囊泡、納米管、納米層等)[5-8]，這些自組裝體往往具有優越的生物學性能，在生物醫藥領域具有廣闊的應用前景，所以脂肽分子的自組裝研究意義重大。

目前，對脂肽自組裝研究的報道較少。Privé課題組[9-10]設計合成了一類脂肽分子，但結構比較復雜，肽鏈較長，難以大規模制備，且在使用前必須實現脂肽的正確折疊，限制了其進一步應用。作者以組氨酸和十

二烷酸為原料，設計合成了3種結構相對簡單的脂肽分子，并對其自組裝特性及其與十二烷基麥芽糖苷(DDM)的復配進行了研究。

1 實驗

1.1 試劑

脂肽C12HH-COOH(≥98%)、C12HH-CONH2(≥98%)、C12HHH-CONH2(≥98%)，自行合成；DDM(生物試劑)、2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES，≥99%)、2-(N-嗎啉)乙磺酸鈉(≥99%)，Sigma-Aldrich公司；三氟乙酸、乙腈、磷酸、磷酸二氫鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；4-羥基-α-氰基肉桂酸(生物試劑)，上海恒遠生物科技有限公司；超純水。

脂肽和DDM的分子結構如圖1所示。

圖1 脂肽和DDM的分子結構Fig.1 Molecular structures of lipopeptides and DDM

1.2 溶液的配制

分別配制500 mL 20 mmol·L-1(pH=6.0/pH=6.5)MES緩沖溶液、500 mL 20 mmol·L-1(pH=3.0)PBS緩沖溶液、10 mL 10% DDM溶液。

分別配制一系列梯度濃度的脂肽溶液，靜置24 h，觀察溶液中是否產生沉淀。將DDM溶液與3種脂肽溶液分別按照10∶1和5∶1的比例進行復配，復配體系中DDM濃度為1.0 mmol·L-1，靜置24 h，觀察復配體系中是否產生沉淀。

1.3 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)分析

用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(Microflex LRF,Bruker)從分子量角度對3種脂肽進行MALDI-TOF-MS分析。首先，將脂肽和基質(4-羥基-α-氰基肉桂酸)以合適的比例溶于超純水(含1%三氟乙酸)-乙腈溶液(1∶1，體積比)中；然后，取1 μL點在靶板上，待溶劑揮發后在自然條件下結晶；最后，將靶板放入質譜儀，用MALDI源的激光照射，單次掃描50～100次，累加信號后得到質譜圖。

1.4 反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析

用Waters 2695 Alliance型反相高效液相色譜系統對3種脂肽進行RP-HPLC分析。稱取一定量的脂肽，加入超純水，配制成1 mmol·L-1的樣品溶液，渦旋并振蕩超聲使其溶解，上樣前需用孔徑0.22 μm的濾頭過濾。脂肽通過疏水作用吸附到C18反相色譜柱上，增大洗脫劑的疏水性來進行洗脫。流動相為含有0.1%三氟乙酸的超純水溶液(A相)和含有0.1%三氟乙酸的乙腈溶液(B相)，40 min內梯度洗脫到95%的乙腈，柱溫25 ℃，流速0.8 mL·min-1，時間45 min，紫外檢測器，210～400 nm全波長檢測。

1.5 臨界膠束濃度(CMC)的測定

CMC是研究表面活性劑聚集行為的重要參數之一。與傳統表面活性劑類似，當脂肽濃度低于CMC時，其在溶液中主要以單體形式存在；當達到CMC時，脂肽開始聚集形成膠束，進而開始組裝。配制一系列梯度濃度的脂肽溶液，在表面張力儀(EasyDyne,Kruss)上采用Wilhelmy板法測定溶液的表面張力。以表面張力對濃度作圖，拐點對應的濃度即為脂肽在緩沖溶液中的CMC。

1.6 膠束粒徑的測定

復配表面活性劑具有單一表面活性劑不具備的性能和功能，因此不同表面活性劑之間的復配備受關注[11-12]。采用動態光散射儀(Nano-ZS,Malvern)測定復配體系膠束粒徑。樣品溶液用孔徑0.22 μm的濾頭過濾，設定溫度25 ℃，穩定時間120 s，每個樣品測定20次，取平均值。

2 結果與討論

2.1 分子量及純度分析

3種脂肽的MALDI-TOF-MS數據分析見表1。

表1脂肽的理論出峰位置與實際出峰位置

Tab.1Theoreticalvaluesandactualvaluesofthelocationoflipopeptidespeaks

從表1可知，3種脂肽分子帶有一個正電荷的分子離子[M+H]+理論值與實測值的差值很小，在測量誤差內相吻合，證明合成的脂肽是設計的目標脂肽。

3種脂肽的RP-HPLC圖譜如圖2所示。

圖2 脂肽的RP-HPLC圖譜

從圖2可以看出，3種脂肽的RP-HPLC圖譜均只有一個主峰，說明合成的脂肽純度較高(HPLC純度≥98%)，滿足實驗要求，可以用于自組裝特性研究。

2.2 表面張力分析

3種脂肽在MES緩沖溶液(20 mmol·L-1，pH=6.0)中的表面張力隨濃度變化曲線如圖3所示。

圖3 3種脂肽在MES緩沖溶液中的表面張力隨濃度變化曲線Fig.3 Variation curves of the surface tension of three lipopeptides in MES buffer solution

從圖3可以看出，3種脂肽C12HH-COOH、C12HH-CONH2和C12HHH-CONH2在MES緩沖溶液(20 mmol·L-1，pH=6.0)中均表現出明顯的表面活性劑特性，其CMC分別為0.40 mmol·L-1、0.63 mmol·L-1、1.10 mmol·L-1。

脂肽C12HH-COOH在不同pH值緩沖溶液中的表面張力隨濃度變化曲線如圖4所示。

從圖4可以看出，脂肽C12HH-COOH的CMC隨著溶液pH值的增大而減小，在pH=3.0的PBS緩沖溶液中為5.00 mmol·L-1，在pH=6.0的MES緩沖溶液中為0.40 mmol·L-1，在pH=6.5的MES緩沖溶液中為0.06 mmol·L-1。這可能與不同pH值溶液中脂肽C12HH-COOH親水頭基(組氨酸)的帶電情況有關。組氨酸的等電點pI約為7.6，R基的pKa約為6.0。因此，在pH=3.0時R基帶一個正電荷；在pH=6.0時R基平均帶0.5個正電荷；在pH=7.6時R基不帶電荷。即脂肽C12HH-COOH所帶正電荷量隨著pH值的增大而減少，親水性減弱，導致CMC減小。

圖4 C12HH-COOH在不同pH值緩沖溶液中的表面張力隨濃度變化曲線Fig.4 Variation curves of the surface tension of C12HH-COOH in buffer solutions with different pH values

脂肽C12HH-CONH2和C12HHH-CONH2的親水頭基也是由組氨酸構成，因此，它們的CMC同樣隨著pH值的增大而減小。

2.3 膠束粒徑分析

將DDM與3種脂肽分別按10∶1和5∶1的比例進行復配，測定不同復配體系的膠束粒徑，結果見表2。

表2不同復配體系的膠束粒徑

Tab.2Theparticlesizeofmicelleindifferentcomplexsystems

復配體系平均粒徑/nm標準偏差DDM(1mmol·L-1)5.070.27DDM∶C12HHCOOH=10∶14.800.33DDM∶C12HHCOOH=5∶14.680.27DDM∶C12HHCONH2=10∶14.610.17DDM∶C12HHCONH2=5∶14.390.20DDM∶C12HHHCONH2=10∶15.170.35DDM∶C12HHHCONH2=5∶15.310.10

從表2可知，在不同復配體系中均能檢測到膠束的存在，其中DDM與C12HH-COOH、C12HH-CONH2復配后的膠束平均粒徑比DDM小，DDM與C12HHH-CONH2復配后的膠束平均粒徑比DDM大。這可能是由于，C12HH-COOH和C12HH-CONH2分子比DDM分子短(圖1)，所以復配后的膠束平均粒徑比DDM小，且復配后的膠束平均粒徑隨脂肽含量的增加逐漸減小；而C12HHH-CONH2分子比DDM分子長(圖1)，故復配后的膠束平均粒徑比DDM大，且復配后的膠束平均粒徑隨著脂肽含量的增加逐漸增大。

3種復配體系的膠束示意圖如圖5所示。

圖5 3種復配體系的膠束示意圖Fig.5 Schematic diagram of micelles in three complex systems

3 結論

以組氨酸和十二烷酸為原料，設計合成了3種脂肽C12HH-COOH、C12HH-CONH2和C12HHH-CONH2。表面張力分析表明，3種脂肽在水溶液中都具有明顯的表面活性劑特性。3種脂肽在MES緩沖溶液(20 mmol·L-1，pH=6.0)中都能形成膠束，且3種脂肽的CMC隨著緩沖溶液pH值的增大而減小。3種脂肽都能與DDM復配自組裝形成混合膠束，且混合膠束的平均粒徑與復配體系中脂肽的含量有關。

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Self-AssembleCharacteristicsofLipopeptideandItsComplexwithn-Dodecyl-β-D-Maltoside

LI Quan,CHENG Lei,YU Dao-yong*,XU Hai

(CenterforBioengineeringandBiotechnology,CollegeofChemicalEngineering,
ChinaUniversityofPetroleum(EastChina),Qingdao266580,China)

Using histidine and dodecanoic acid as raw materials,we synthesized three lipopeptides C12HH-COOH,C12HH-CONH2，and C12HHH-CONH2.Molecular structures of such lipopeptides contain dodecanoic acid hydrophobic alkane chain and histidine hydrophilic peptide chain,therefore they have the structural features of traditional surfactants and peptide surfactants.The surface tension analysis indicated that,three lipopeptides exhibited significant surfactant properties in aqueous solution,and the critical micelle concentrations(CMC) in MES buffer solution(20 mmol·L-1,pH=6.0) were 0.40 mmol·L-1,0.63 mmol·L-1,and 1.10 mmol·L-1,respectively.As the pH value of MES buffer solution decreased,the chargeability of the hydrophilic head group histidine side chain and the CMC increased.Three lipopeptides were able to form mixed micelles by self-assembly with the traditional surfactantn-dodecyl-β-D-maltoside(DDM),and the average particle size of mixed micelles was related to the lipopeptide content of complex system.

lipopeptide;self-assembly;surfactant;complex

O69

A

1672-5425(2017)10-0016-04

國家自然科學基金項目(21673292)，山東省自然科學基金項目(ZR2014BM013)，教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目(20130133110011)

2017-06-01

李泉(1991-)，男，山東膠州人，碩士研究生，研究方向：生物能源，E-mail:S15030507@s.upc.edu.cn；通訊作者：于道永，副教授，E-mail:daoyong@upc.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.004

李泉，成磊，于道永，等.脂肽的自組裝特性及其與十二烷基麥芽糖苷的復配研究[J].化學與生物工程，2017，34(10)：16-19，31.