一株產木聚糖酶菌株的篩選及發酵產酶條件優化

張慶芳，許 晶，楊旭立，郭賽賽

(1.蘭州理工大學能源與動力工程學院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州理工大學石油化工學院，甘肅 蘭州 730050)

一株產木聚糖酶菌株的篩選及發酵產酶條件優化

張慶芳1，2，許 晶2，楊旭立2，郭賽賽2

(1.蘭州理工大學能源與動力工程學院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州理工大學石油化工學院，甘肅 蘭州 730050)

以木聚糖為唯一碳源，從含有大量腐爛枯枝樹葉土壤中篩選到一株高產木聚糖酶菌株，經形態學分析和分子學鑒定，確定其為鏈霉屬(Streptomyces)。通過單因素實驗考察了碳源、氮源、初始pH值、發酵溫度和發酵時間對酶活的影響；在單因素實驗的基礎上，利用Design-Expert軟件對碳源、氮源和發酵時間進行響應面分析。單因素實驗確定適宜發酵產酶條件為：復合碳源為玉米芯粉+蔗糖(1∶2)、氮源為硝酸銨、初始pH值4.0、發酵時間2.5 d、發酵溫度30 ℃，此時，所產木聚糖酶酶活為511 U·mL-1；響應面分析確定最優發酵產酶條件為：復合碳源(玉米芯粉∶蔗糖=1∶2)添加量4.09%、氮源硝酸銨添加量1.16%、初始pH值4.0、發酵時間3.14 d、發酵溫度30 ℃，此時，所產木聚糖酶酶活達到641 U·mL-1,較單因素實驗提高了25.44%。

半纖維素酶；木聚糖酶；發酵；響應面分析

我國是農業大國，每年都會產生大量可回收利用的農業廢棄物，其中大部分為農作物秸稈，據統計我國每年農作物秸稈產量在6億t左右，其中玉米秸稈總產量達到2.2億t。秸稈中含有大量的生物質資源，如何合理高效利用秸稈中的生物質已引起世界各國的普遍關注，并逐漸成為農業可持續發展過程中至關重要的因素[1]。半纖維素約占木質纖維素物質的32%，僅次于纖維素(35%)。因此如何低成本、高效利用半纖維素類物質對充分利用我國大量秸稈資源具有重要意義[2]。

半纖維素是由幾種不同類型的單糖構成的異質多聚體,這些糖是五碳糖和六碳糖，包括戊糖(D-木糖、L-阿拉伯糖)、己糖(D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖)和糖醛酸(D-葡萄糖醛酸)等[3]。早期對半纖維素的研究主要集中在通過物理或化學的方法將其轉化成小分子的糖類、化學品、燃料和能量，主要方法包括：過氧化氫抽提法、堿液抽提法、熱處理法和機械處理法，但這些方法對設備要求較高、對環境影響較大，很難得到進一步的發展[4]；現階段，主要采用生物方法來處理半纖維素，利用高產半纖維素酶的微生物將半纖維素分解成小分子物質，生物方法比較溫和，對設備要求不高，對環境影響較小。半纖維素酶是一個復雜的酶系，很多半纖維素酶是以木糖為主鏈，側鏈有甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖等單糖，分解半纖維素的有木聚糖酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶等。產木聚糖酶的微生物種類眾多，在陸地和海洋中都普遍存在[5]，主要包括好氧和厭氧細菌、絲狀真菌、放線菌、酵母菌、藻類和古菌等，現階段研究的產木聚糖酶微生物主要是絲狀真菌類[6-7]。

發酵條件的不斷優化是提高產酶量和酶活的重要方法之一。優化的發酵條件主要通過單因素實驗和正交實驗得到，但都無法得到整個區域上各個因素之間的最佳組合和響應值的最優值[8-9]。而Design-Expert軟件可以快速、可靠、簡易地進行實驗設計和數據分析。

課題組前期篩選出高產纖維素酶的菌株[9]，在此以木聚糖為唯一碳源，從含有大量腐爛枯枝樹葉的土壤中篩選高產木聚糖酶菌株，并在單因素實驗的基礎上，利用Design-Expert對發酵產酶條件進行優化，以期最大程度地提高菌株產酶能力[10]，為秸稈的資源化利用提供幫助。

1 實驗

1.1 土樣、試劑與儀器

土樣，取自含有大量腐爛枯枝樹葉的土壤。

木聚糖(純度≥85%)、D-木糖、乳酸酚棉藍染色液。

恒溫氣浴振蕩器、超凈工作臺、紫外分光光度計、pH計、滅菌鍋。

1.2 培養基

初篩培養基：(NH4)2SO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g,NaCl 0.5 g，木聚糖 2 g,瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

查氏培養基：NaNO33 g，K2HPO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO40.01 g，KCl 0.5 g，蔗糖 30 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL。

種子培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

產酶培養基：(NH4)2SO45 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母粉 5 g，木聚糖5 g，蒸餾水1 000 mL。

液體發酵培養基：250 mL三角瓶中裝2 g碳源，加100 mL無機鹽溶液，NH4NO30.5%。

1.3 木聚糖酶產生菌的篩選

1.3.1 富集

稱取土樣5 g，加100 mL無菌水，于30 ℃、170 r·min-1恒溫搖床富集培養10～12 h。

1.3.2 分離純化

取出菌液，靜置30 min，吸取上清液進行10倍梯度稀釋；分別吸取10～105梯度濃度菌液各0.1 mL均勻涂布到初篩培養基上，每個稀釋度做2個重復，于30 ℃恒溫培養若干天；根據透明圈的大小挑選菌株接種于查氏培養基上，30 ℃恒溫培養5 d；再挑取單菌落于查氏培養基上，如此反復，直到培養菌株被純化為止。

1.3.3 種子培養液的制備

挑取一環純化菌株接種到50 mL(100 mL三角瓶)種子培養基中，于30 ℃、170 r·min-1恒溫振蕩培養48 h，即得種子培養液。

1.3.4 發酵液的制備

吸取10 mL種子培養液至100 mL(250 mL三角瓶)產酶培養基中，于30 ℃、170 r·min-1恒溫振蕩培養5 d，即得發酵液。測定發酵液中木聚糖酶的酶活，做3個平行，取平均值。

1.3.5 保存

PDA培養基短期保存：每批樣取2個菌落，接種到PDA斜面培養基上，于30 ℃、170 r·min-1搖床振蕩培養，待長出明顯菌落后放入4 ℃冰箱中短期保存。

甘油低溫(-71 ℃)長期保存：每批樣取2個菌落，接種到8 mL LB種子培養基中，于30 ℃、170 r·min-1搖床擴大培養，待長出明顯菌落后加入2 mL滅菌甘油，在振蕩器中搖勻，將搖勻的菌體移至2 mL保菌管中，放入保菌盒，于-71 ℃下保存。

1.4 木聚糖酶產生菌的鑒定

有一天，穎春開著一輛車來到了野豬坳，她是帶女兒來看我的。秀紅非常熱情地接待了她和女兒，又是殺土雞又是煮野菜的。吃飯的時候，女兒高興地對我說，爸爸，告訴你一個好消息，媽媽當官了，是你原來的那個位置，縣農業局副局長。

利用真菌ITS兩端的保守引物PCR擴增未知菌株的ITS片段，進行DNA測序，與NCBI GenBank中的已知序列進行同源性比對后，判斷木聚糖酶產生菌的種類，并劃分到屬或種。

1.5 木聚糖酶的酶活測定

采用DNS法測定木聚糖酶的酶活：吸取適當稀釋的發酵液0.5 mL，加到1.5 mL用pH值為4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制的1%木聚糖溶液中，50 ℃酶解30 min；加入3 mL DNS試劑，沸水浴中加熱5 min；用冰水迅速冷卻，補加蒸餾水至25 mL，測定540 nm處吸光度。以高壓鍋滅活的發酵液作對照。

酶活力單位定義：在50 ℃、pH值 5.0的條件下，水解木聚糖底物1 min所產生的酶量為一個酶活力單位(U)[11]。

式中：W為酶解反應生成的木糖量，可從木糖標準曲線查得，mg；N為發酵液的稀釋倍數；30為酶解時間，min；V為反應液體積，mL。

1.6 木聚糖酶產生菌發酵產酶條件優化

首先研究了碳源、氮源、初始pH值、發酵時間和發酵溫度對菌株發酵產酶的影響，確定幾個主要影響因素；再利用Design-Expert軟件對碳源、氮源和發酵時間進行實驗設計和數據分析，得到最佳發酵產酶條件[12]。

2 結果與討論

根據透明圈的大小挑選若干菌株，接種于查氏培養基中，反復接種多次，得到純化的菌株；經種子培養基擴大培養，再接種到發酵培養基中；取發酵液的上清液，測定酶活，得到一株酶活力較高的菌株。

上海生工生物公司對該菌株進行分子學鑒定，確定其為鏈霉屬(Streptomyces)，主要包括海洋白淺灰鏈霉菌、綠色產色鏈霉菌、灰略紅鏈霉菌、暗黑微綠鏈霉菌、潮濕鏈霉菌和大孢子鏈霉菌，含量達到99%。

2.2 產酶條件的單因素優化

2.2.1 碳源

保持液體發酵培養基其它成分不變，分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米芯粉、小麥稈粉、玉米稈粉、甘蔗渣作為唯一碳源，于30 ℃、170 r·min-1發酵3 d，測定酶活，考察不同碳源對酶活的影響，結果見圖1。

圖1 不同碳源對酶活的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on enzyme activity

從圖1可以看出,蔗糖和玉米芯粉作為唯一碳源時，酶活較高，分別為324 U·mL-1和321 U·mL-1。

在此基礎上，以玉米芯粉+蔗糖作為復合碳源，考察其對酶活的影響，結果見圖2。

圖2 復合碳源對酶活的影響Fig.2 Effect of composite carbon sources on enzyme activity

從圖2可以看出，復合碳源玉米芯粉+蔗糖的最佳比例為1∶2，此時，酶活可達365 U·mL-1。

2.2.2 氮源

保持液體發酵培養基其它成分不變，分別以無機氮源氯化銨、硝酸銨和有機氮源蛋白胨、酵母粉作為唯一氮源，于30 ℃、170 r·min-1發酵3 d，測定酶活，考察不同氮源對酶活的影響，結果見圖3。

從圖3可以看出，以硝酸銨作為唯一氮源時，酶活最高，為416 U·mL-1。

2.2.3 初始pH值

用0.1 mol·L-1檸檬酸和氫氧化鈉溶液調節無機鹽溶液的初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以最佳碳源和氮源配制液體發酵培養基，于30 ℃、170r·min-1發酵3 d，測定酶活，考察初始pH值對酶活的影響，結果見圖4。

圖3 不同氮源對酶活的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity

圖4 初始pH值對酶活的影響Fig.4 Effect of initial pH value on enzyme activity

從圖4可以看出，隨著初始pH值的不斷增大，酶活逐漸降低，在初始pH值為4.0時,酶活最高，為448 U·mL-1。

2.2.4 發酵時間

以玉米芯粉+蔗糖(1∶2)為復合碳源、硝酸銨為氮源，在初始pH值為4.0的條件下發酵96 h，每隔12 h測定一次酶活，考察發酵時間對酶活的影響，結果見圖5。

圖5 發酵時間對酶活的影響Fig.5 Effect of fermentation time on enzyme activity

從圖5可以看出，發酵12～60 h，酶活波動較大，但總體呈上升趨勢；發酵60 h時，酶活達到最高，為488 U·mL-1；之后，酶活隨著發酵時間的延長逐漸降低。

2.2.5 發酵溫度

以玉米芯粉+蔗糖(1∶2)為復合碳源、硝酸銨為氮源，在初始pH值為4.0的條件下，分別在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃發酵60 h，測定酶活，考察發酵溫度對酶活的影響，結果見圖6。

圖6 發酵溫度對酶活的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on enzyme activity

從圖6可以看出，當發酵溫度為30 ℃時，酶活最高，為511 U·mL-1。

2.3 產酶條件的多因素優化

2.3.1 實驗設計

在單因素優化實驗的基礎上，設置初始pH值為4.0、發酵溫度為30 ℃、搖床轉速為170 r·min-1，用Design-Expert軟件對碳源、氮源和發酵時間進行多因素優化實驗，結果見表1。

2.3.2 效應面優化與預測

根據多因素優化實驗中的碳源、氮源和發酵時間的不同取值，得到對應的酶活值，利用Design-Expert軟件繪制各因素的交互作用對酶活影響的三維曲面圖，如圖7所示。

按照上述限定的優化條件，確定優化方案為：X1=4.09%、X2=1.16%、X3=3.14 d，Y=640 U·mL-1。

2.3.3 驗證實驗

在優化方案下，即復合碳源(玉米芯粉∶蔗糖=1∶2)添加量為4.09%、氮源硝酸銨添加量為1.16%、初始pH值為4.0、發酵時間為3.14 d、發酵溫度為30 ℃，分3批(每批3組)進行驗證實驗。第一批：642 U·mL-1、646 U·mL-1、635 U·mL-1，平均值641 U·mL-1；第二批：629 U·mL-1、650 U·mL-1、641 U·mL-1，平均值640 U·mL-1；第三批：630 U·mL-1、646 U·mL-1、650 U·mL-1，平均值642 U·mL-1；3批平均值為641 U·mL-1，與預測值非常接近，比單因素實驗的最佳酶活值提高了25.44%。

表1Design-Expert多因素優化實驗結果(n=3)

Tab.1

Results of multi-factors optimization

3 結論

以木聚糖為唯一碳源，從含有大量腐爛枯枝樹葉的土壤中篩選出若干菌株，利用DNS法篩選得到一株產酶量最高的目標菌株。經過單因素實驗，確定最佳的碳源、氮源、初始pH值、發酵時間和發酵溫度；然后利用Design-Expert軟件對碳源、氮源和發酵時間進行響應面分析，得到了最佳的發酵產酶條件：復合碳源(玉米芯粉∶蔗糖=1∶2)添加量為4.09%、氮源硝酸銨添加量為1.16%、初始pH值為4.0、發酵時間為3.14 d、發酵溫度為30 ℃，在此條件下，所產木聚糖酶的酶活達到641 U·mL-1，比單因素實驗提高了25.44%。該研究為生物法利用半纖維素、加快我國秸稈資源生物法利用、緩解我國能源資源的短缺和環境污染的壓力提供了一條有效途徑。

圖7 各因素的交互作用對酶活影響的三維圖Fig.7 Three dimensional diagram for effects of interaction of each factor on enzyme activity

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ScreeningofAXylanase-ProducingStrainandOptimizationinFermentationConditions

ZHANG Qing-fang1，2,XU Jing2,YANG Xu-li2，GUO Sai-sai2

(1.SchoolofEnergyandPowerEngineering,LanzhouUniversityofTechnology,Lanzhou730050,China;
2.SchoolofPetrochemicalEngineering,LanzhouUniversityofTechnology,Lanzhou730050,China)

Using xylan as a sole carbon source,we screened a high xylanase-producing strain from soil which contained a lot of rotten dead branch leaves.The strain belongs toStreptomycesby morphological analysis and molecular biology identification.We investigated the effects of carbon source,nitrogen source,initial pH value,fermentation temperature,and fermentation time on enzyme activity by single-factor experiment.On the basis of single-factor experiment,we carried out the response surface analysis of carbon source,nitrogen source,and fermentation time by Design-Expert software.The single-factor experiment showed that the enzyme activity of xylanase was 511 U·mL-1when the appropriate fermentation conditions were as follows:composite carbon source was corncob powder and sucrose(1∶2),nitrogen source was ammonium nitrate,initial pH value was 4.0,fermentation time was 2.5 d,and fermentation temperature was 30 ℃.The response surface analysis showed that the enzyme activity of xylanase reached 641 U·mL-1which increased by 25.44% over that of single-factor experiment when the optimal fermentation conditions were as follows:the addition of composite carbon source(corncob powder∶sucrose=1∶2) was 4.09%,the addition of nitrogen source ammonium nitrate was 1.16%,initial pH value was 4.0,fermentation time was 3.14 d,and fermentation temperature was 30 ℃.

hemicellulase;xylanase;fermentation;response surface analysis

TQ920 Q814.1

A

1672-5425(2017)10-0020-05

國家自然科學基金項目(21667017)

2017-05-21

張慶芳(1972-)，女，甘肅天水人，副教授，主要從事固體廢物資源化與能源化的科研與教學工作，E-mail:zhangqingfang_19@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.005

張慶芳，許晶，楊旭立，等.一株產木聚糖酶菌株的篩選及發酵產酶條件優化[J].化學與生物工程，2017，34(10)：20-24，31.