6-姜酚對抗丙酮醛引起的HK-2腎小管上皮細胞損傷的機制

陳燕玲*，羅 婷，凡 棟，吳秀香，王曉玲，黃霜枝

（遵義醫學院珠海校區病理生理學教研室，廣東 珠海 519041）

?基礎研究?

6-姜酚對抗丙酮醛引起的HK-2腎小管上皮細胞損傷的機制

陳燕玲*，羅 婷，凡 棟，吳秀香，王曉玲，黃霜枝

（遵義醫學院珠海校區病理生理學教研室，廣東 珠海 519041）

目的探討6-姜酚對丙酮醛引起的HK-2腎小管上皮細胞（HK-2細胞）損傷的可能機制。方法 實驗分為四組：對照組、丙酮醛損傷組、丙酮醛+6-姜酚組（丙酮醛與6-姜酚共處理）及6-姜酚組。用DCFH-DA（雙氯熒光素）染色法檢測HK-2細胞內活性氧（ROS）的水平；比色法測點細胞SOD（超氧化物歧化酶）活力；western blot法檢測NF-κB蛋白表達水平。結果 與對照組相比，丙酮醛損傷組HK-2細胞內ROS水平明顯增高，SOD活力明顯降低，而NF-κB蛋白表達水平明顯增高；加入6-姜酚處理后，HK-2細胞內ROS水平及NF-κB蛋白表達水平明顯降低，而SOD活力明顯增高。結論 6-姜酚對抗丙酮醛引起的HK-2細胞損傷的機制可能與其提高細胞抗氧化能力及抑制NF-κB介導的炎癥通路有關。

6-姜酚；丙酮醛；氧化應激；NF-κB

干姜是一種傳統的藥食兩用植物，從干姜中分離出姜酚的結晶體，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等，其中6-姜酚是干姜中最主要的活性成分[1]。本課題組之前的研究發現，6-姜酚可以對丙酮醛引起的HK-2腎小管上皮細胞損傷具有明顯的保護作用，但其機制未明。因此，本研究旨在探討6-姜酚對抗丙酮醛引起的HK-2細胞損傷作用的機制。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞株

由中山大學中山醫學院饋贈。

1.1.2 藥品與主要試劑

6-姜酚（純度＞98%）購自上海同田生物技術有限公司，丙酮醛（純度＞95%）購自上海源葉生物科技有限公司，DCFH-DA（雙氯熒光素）購自Sigma，SOD試劑盒購自南京建成公司，NF-κB抗體及β-actin抗體均購自Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 細胞內活性氧（ROS）水平檢測

取對數生長期的細胞接種于6孔板，每孔1000 μL，分為對照組、丙酮醛損傷組、丙酮醛+6-姜酚組及6-姜酚組。其中丙酮醛和6-姜酚處理濃度分別為400 μmol/L和200 μmol/L。細胞給予相應藥物處理24 h后，加入1 μg/LDCFH-DA染色液，于37℃下避光孵育30 min，然后在熒光顯微鏡下觀察，隨機選取10個不重復區拍照。

1.2.2 HK-2細胞內SOD活力檢測

將HK-2細胞接種于24孔板，每組設置4個復孔。按照實驗分組加入藥物處理24后。將細胞培養上清液收集到EP管中，300 0rpm/min，離心10 min后吸取上清。按照南京建成公司SOD檢測試劑盒操作說明進行檢測。

1.2.3 Western blot 法檢測NF-κB蛋白表達水平

將HK-2細胞按相應密度接種于60 mm培養皿中，按實驗分組加入藥物處理。24h后去掉培養基，用預冷的PBS洗兩遍，每皿加入100 μL細胞裂解液，在冰上裂解細胞，提取細胞總蛋白。每個泳道蛋白上樣量為50 μg，電泳：恒壓80V 30 min，100V 60 min。220 mA恒流轉膜1h。用5%脫脂奶粉封閉1h后加入NF-κB抗體及β-actin抗體，β-actin作為內參。4℃搖床上孵育過夜，加入二抗。經曝光、顯影及定影后，使用ImageJ軟件分析條帶的相應灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料用“±s”表示，采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 6-姜酚對丙酮醛誘導的HK-2細胞細胞內ROS水平的影響

DCFH-DA（2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽）本身沒有熒光，進入細胞后可被水解生成DCFH，在活性氧存在的情況下，DCFH被氧化生成熒光物質DCF，綠色熒光強度與細胞內活性氧水平成正比。如圖1所示，對照組細胞內綠色熒光強度較弱，僅有少量ROS生成，而經400 μmol/L的丙酮醛處理后，細胞內綠色熒光強度明顯增強，說明ROS水平明顯升高；而加入6-姜酚共處理后，綠色熒光強度又顯著減弱，明顯抑制了丙酮醛誘導的ROS的生成。

圖1 6-姜酚對丙酮醛誘導的HK-2細胞細胞內ROS水平的影響

2.2 6-姜酚對丙酮醛誘導的HK-2細胞細胞內SOD活力的影響

如圖2所示，HK-2細胞經丙酮醛處理后的SOD活力明顯降低，而加入6-姜酚共處理后，SOD活力明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 6-姜酚對丙酮醛誘導的HK-2細胞細胞內NF-κB蛋白表達水平的影響

如圖3所示，HK-2細胞經400 μmol/L的丙酮醛處理后，炎性細胞因子合成的關鍵轉錄因子NF-κB蛋白表達水平明顯增高，而加入6-姜酚共處理后，NF-κB蛋白表達水平明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 6-姜酚對丙酮醛誘導的HK-2細胞細胞內NF-κB蛋白表達水平的影響

3 討 論

我國糖尿病發病率很高，總人數達9200萬人，而隨著全球范圍內糖尿病患者人數的不斷增加，糖尿病腎病發病率也會隨之增高[2]。研究發現，丙酮醛是引起糖尿病組織細胞損傷的關鍵因素[3]。因此，尋求有效對抗丙酮醛損傷的藥物是我們臨床治療糖尿病腎病的重要內容。我們先前報道干姜的主要活性成分——6-姜酚對丙酮醛誘導的HK-2腎小管上皮細胞具有保護作用，但機制尚未闡明。研究報道，6-姜酚可以通過抗氧化作用以及調節NF-κB對抗阿霉素引起的心肌細胞凋亡[1,4]。本研究結果顯示，6-姜酚可以明顯抑制丙酮醛引起的HK-2細胞內ROS的生成以及NF-κB蛋白的表達水平，并且提高細胞內SOD的活力。表明6-姜酚可能通過提高HK-2細胞的抗氧化應激能力及抑制NF-κB介導的炎癥通路對抗丙酮醛引起的HK-2細胞損傷。本實驗將為干姜在臨床上的應用提供理論依據。

[1] Chen YL,Zhuang XD,Xu ZW,et al,Higenamine Combined with 6-Gingerol Suppresses Doxorubicin-Triggered Oxidative Stress and Apoptosis in Cardiomyocytes via Upregulation of PI3K/Akt Pathway,Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:970490.

[2] Yang W,Lu J,Weng J,et al,Prevalence of diabetes among men and women in China.N Engl J Med,2010,362(12):1090-101.

[3] Beisswenger PJ,Howell SK,Russell GB,et al.,Early progression of diabetic nephropathy correlates with methylglyoxal-derived advanced glycation end products.Diabetes Care,2013,36(10):3234-9.

[4] El-Bakly WM,Louka ML,El-Halawany AM,et al,6-gingerol ameliorated doxorubicin-induced cardiotoxicity:role of nuclear factor kappa B and protein glycation.Cancer Chemother Pharmacol,2012 Dec;70(6):833-41.

R285.5

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ISSN.2095-8242.2017.052.10111.03

國家自然科學基金資助項目（NO.：81560133）；貴州省科技合作計劃項目（NO.：黔科合LH字[2015]7529號）；遵義醫學院博士科研啟動基金

陳燕玲，E-mail：546475534@qq.com

本文編輯：趙小龍