流感丸中烏頭堿含量測定研究

張有新，仇朝紅，劉學良

（1.青海省互助縣人民醫院，青海 海東 810500；2.青海省藥品不良反應監測中心，青海 西寧 810000；3.青海省食品藥品審評中心，青海 西寧 810007）

流感丸中烏頭堿含量測定研究

張有新1，仇朝紅2，劉學良3

（1.青海省互助縣人民醫院，青海 海東 810500；2.青海省藥品不良反應監測中心，青海 西寧 810000；3.青海省食品藥品審評中心，青海 西寧 810007）

目的建立測定流感丸中烏頭堿含量測定的高效液項色譜（HPLC）法。方法采用Hypersil-ODS C18柱色譜柱，以乙腈-四氫呋喃為流動相A，0.1 mol/L醋酸銨溶液為流動相B，（A:B）比例為（15:85）為；柱溫為30℃；檢測波長為240 nm。理論板數按烏頭堿峰計算應不低于3000。結果在上述條件下，對烏頭堿測定峰沒有干擾，在0.1034 μg～1.2051 μg范圍內與色譜峰面積之間線性關系良好。結論本方法準快速、簡便、準確，可用于流感丸中烏頭堿含量的HPLC測定。

流感丸；烏頭堿；HPLC；

流感丸中草烏具有溫經止痛和祛風除濕的功效，常用于心腹冷痛、風寒濕痹等疾病治療。流感丸中草烏的主要成分為烏頭堿及次烏頭堿等，這些成分既是有效成分也是毒性成分。榜嘎通常以全草入藥，烏頭則多以塊根或根入藥[1]。榜嘎性涼、味苦，是藏醫常用藥物，具清熱解毒的功效，在各種藏藥復方制劑中較為常用。

1 儀器及試藥

本研究所使用儀器為電子天平、高效液相色譜儀、紫外檢測器、超聲波清洗器乙腈、甲醇、四氫呋喃均為色譜純。烏頭堿（批號：110720-201111，含量按98.8%計）、新烏頭堿（批號：110799-201106，含量按98.5%計）、次烏頭堿（批號：110798-200805，含量按99.5%計）對照品。

2 方法與結果

2.1 測定波長的選擇

根據二極管陣列檢測器得到的紫外吸收光譜圖及最大吸收波長顯示，新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的最大吸收波長為240 nm。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗考察：

流動相A和B分別為乙腈-四氫呋喃（25:15）和0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），（A:B）比例為（15:85）作為流動相；檢測波長為240 nm，流速1.0 mL/分鐘，填充劑使用十八烷基硅烷鍵合硅膠。

應用Hypersil-ODS C18柱與Sunfire C18柱（250 mm×4.6 mm），對以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀-醋酸-異丙醇（27:69:2:2）、甲醇-0.3 mol/L三乙胺（65:35）、以乙腈-四氫呋喃（25:15）為流動相A，0.1 mol/L醋酸銨溶液為流動相B，（A:B）比例為（15:85）為流動相時的分離情況進行考察，柱溫為30℃，（A:B）比例為（15:85）為流動相，按烏頭堿峰計算理論板數應在3000以上。

2.3 制備對照品溶液

烏頭堿對照品準確稱取12.11 mg、新烏頭堿對照品8.79 mg、次烏頭堿對照品10.33 mg，將異丙醇-三氯甲烷混合溶液加入到10mL容量瓶中，稀釋后獲得每1 mL含烏頭堿1.1965 mg、新烏頭堿0.8658 mg、次烏頭堿1.0278 mg的溶液。精密量取上述三種溶液各1 mL，并在容量瓶中加入異丙醇-三氯甲烷混合溶液，待其稀釋后獲得含烏頭堿0.11965 mg/mL、新烏頭堿0.08658 mg/mL、次烏頭堿0.10278 mg/mL的溶液。再精密量取上述稀釋后溶液至10 mL容量瓶中，按1:1比例加入加異丙醇-三氯甲烷混合溶液，稀釋后得含烏頭堿11.965 μg、新烏頭堿8.658 μg、次烏頭堿10.278 μg每毫升的混合溶液。

2.4 制備供試品溶液

2.4.1 提取方法的考察

方法一（水提氯仿萃取法）取本品10 g，加水振蕩后轉移至離心管中，離心5分鐘后取上清液，用0.04%HC1將沉淀洗2次，用10%氨水將pH值調為10，用氯仿萃取3次后，將10 mL的異丙醇-二氯甲烷（1:1）混合溶液加入到殘渣中，取續濾液。

方法二（異丙醇-乙酸乙酯提取法）取10 g本品粉末，稱定后將其置于具塞錐形瓶中，按1:1的比例加入異丙醇-乙酸乙酯混合液50 mL和5 mL氨試液，經超聲處理30分鐘后冷卻，稱定重量后補足減失的重量，搖勻濾過后在殘渣中加入異丙醇-二氯甲烷混合溶液10 mL，經溶解濾過后取續濾液即可。

方法三（氨乙醚冷浸法）取本品粉末10 g，置于具塞錐形瓶中，加氨試液5 mL和乙醚50 mL，振蕩5分鐘，冷浸6小時，轉移至50 mL離心管中，離心5分鐘后取乙醚液，并在殘渣中加10 mL甲醇溶解，濾過，取續濾液，即得。

方法四（氨乙醚超聲法）取10 g粉末置于具塞錐形瓶中，精密加5 mL氨試液和50 mL乙醚，經超聲處理半小時后轉移至離心管中，離心5分鐘后取乙醚液，加甲醇10 mL對殘渣進行溶解，濾過后取續濾液，即得。

方法五（酸提氯仿萃取法）取本品粉末約15 g，置于具塞錐形瓶中，加50 mLHC1溶液，振蕩6小時，轉移至50 mL離心管中，離心5 min，獲取上清液后用0.04%HC1洗沉淀2次，用氨水將pH值調為10，加氯仿萃取3次，在殘渣中加入異丙醇-二氯甲烷混合溶液后取續濾液。

測定上述5種提取方法所得樣品的含量，各種提取方法的提取率順序為：方法三＞方法四＞方法二＞方法五＞方法一。確定方法三（氨乙醚冷浸法）為最有效的提取方法。

2.4.2 提取時間的考察

取本品10g，加氨試液5 mL，加乙醚50 mL，振蕩5分鐘，冷浸4、6、8小時，轉移至50 mL離心管中，離心5 min后取乙醚液，用乙醚洗2次沉淀后合并乙醚液，蒸干。加甲醇2mL溶解殘渣，濾過，取續濾液，即得。按照“2.2項”方法測定三種生物堿總含量。6、8小時所測得的三種生物堿總含量接近，以6小時為提取時間。

2.5 制備陰性對照溶液

取除榜嘎、草烏外的其余藥味，制成不含榜嘎、草烏的制劑，制備陰性對照溶液。測定發現供試品溶液在對照品溶液出峰位置上無峰出現，說明對其無干擾。

2.6 樣品測定結果

本研究中，3批樣品的含量測定結果見表1。

表1 3批樣品含測結果（n，%）

3 討 論

稀鹽酸和氨乙醚提取法是提取烏頭類生物堿較為有效的方法，烏頭類生物堿難溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶劑，在服用烏頭屬中藥時，常用水煎煮法[2]，所以本實驗對以氯仿、乙醚為溶劑的提取方法進行了對比。

烏頭類生物堿在水中無法全部被溶出，溶解度低，所以水提取氯仿萃取法與其他方法相比提取率較低[3]。氨乙醚冷浸法則具有較高的提取率，其主要原因在于堿性環境下，烏頭類生物堿能充分溶于有機溶劑并被萃取出來，其他方法的提取率均低于氨乙醚冷浸法[4]。

經測定發現，三批流感丸中的新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿含量在3.6547 μg/g～3.9215 μg/g之間，取樣量低于5 g時，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿三個峰低于定量限，取樣量超過15 g后樣品中雜質干擾較大，不利于檢測，故在試驗中取樣量定為10 g[5]。流感丸標示重量為0.25 g，用法用量為：一次4～8丸，一日2～3次，按日最高服用劑量（一次8丸，一日3次，流感丸中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的總量以4 μg/g計）來計算，日服烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的總量為24 μg，有必要采用高效液相色譜法對其進行烏頭堿限量控制。

[1] 楊秀芳,王 峰.含烏頭堿類藥物致不良反應的特點及規律,中外健康文摘2013,10(21):371-372.

[2] 劉高宏,魏立莉.流感丸中烏頭堿的限量檢查及HPLC含量測定方法的建立[J].西部中醫藥,2016,29(11):24-26.

[3] 吳成鳳,李國衛,王樟根.LC-MS/MS法同時測定烏頭湯中烏頭堿型生物堿含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2015(6):833-837.

[4] 袁 帥,許 玉,黃 磊.烏頭屬藥材中單酯型烏頭堿的ELISA法測定[J].中國醫藥工業雜志,2016,47(7):897-901.

[5] 魏文芝,海 平,駱桂法.超高效液相色譜—質譜聯用法測定藏藥薩熱十三味鵬鳥丸中烏頭堿類含量[J].中國藥業,2016,25(18):25-29.

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ISSN.2095-8242.2017.38.7497.02

本文編輯：王雨辰