沙田柚RING-H2 finger基因的生物信息學分析

李惠敏，羅 瓊，肖 君，李少梅，劉華英，秦新民

(廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541004)

沙田柚RING-H2finger基因的生物信息學分析

李惠敏，羅 瓊，肖 君，李少梅，劉華英，秦新民*

(廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541004)

為探討沙田柚自交不親和性的機理，利用高通量測序技術對沙田柚自交和異交花柱進行轉錄組測序，通過差異分析得到了沙田柚RING-H2 finger基因序列。采用生物信息學方法，對其編碼的蛋白質從序列特征、理化性質、跨膜結構域、高級結構以及功能域等方面進行了預測和分析。結果表明：該基因全長為845 bp，開放閱讀框(ORF)全長為387 bp，編碼128個氨基酸，編碼蛋白質的分子量為13.61 KDa，理論等電點為4.26； 該蛋白質含有一個植物RING-H2 finger蛋白家族的保守結構域，為疏水性不穩定蛋白。氨基酸序列分析表明，其編碼的氨基酸與甜橙(Cs4g15340.1)RING-H2 finger 蛋白的相似度為98%。這些分析結果可為今后深入研究該蛋白的結構特征和功能提供參考。

沙田柚；RING-H2 finger蛋白基因；生物信息學；環指結構域

自交不親和(self-incompatibility)是廣泛存在于顯花植物中的一種生殖隔離現象，從而能夠拒絕自交花粉的生長，使非自交花粉完成正常的授粉受精[1-2]。闡明自交不親和性的分子機理在植物生殖學和培育無子品種等方面具有重要的理論和應用價值。目前研究表明，S-核酸酶(S-RNase)為花柱S-決定因子。花柱中的S-RNase進入花粉管，S-RNase的細胞毒素作用使自交花粉管中的RNA降解，導致蛋白質合成終止，花粉管生長受到抑制，產生自交不親和現象[3-5]。在花粉決定因子方面，F-box基因可能在植物自交不親和中發揮作用。Lai等[6]在金魚草(Antirrhinum)中克隆了一個在花粉中特異性表達的F-box基因(AhSLF-S2)。隨后，分別從茄科矮牽牛(Petuniainflate)中得到S-locus F-box基因PiSLF2[7]，梅(Prunusmume)和扁桃(Prunusdulcis)中鑒定出特異性的S-locus F-box基因PmSLF和PdSFB[8-10]。

RING finger 基因編碼的蛋白是一個龐大的蛋白家族，其典型的結果特點是序列內包含環指結構域(RING finger domain)。目前的研究結果表明大部分的RING finger蛋白具有泛素連接酶E3(Ubiquitin-protein ligating enzyme)活性，是泛素調節的蛋白降解途徑中識別底物的關鍵因子。RING finger蛋白通過單泛素化修飾和多聚泛素化修飾靶蛋白而廣泛參與植物的胚胎發生、細胞周期調節、生長發育、激素信號轉導、程序化死亡，以及逆境脅迫等過程[11]。泛素化降解途徑為解釋植物配子體自交不親和機理的模型之一。RING finger蛋白在該途徑中起關鍵作用[12-13]。 金魚草中發現的S位點F-box基因AhSLF-S2，在花粉中特異表達，能與Skp和Cullin-like蛋白結合形成SCF(Skpl-Cullin-F-box)復合物[6，14]。SCF復合物中包括RING finger domain的蛋白Rbx/Roc/Hrt 負責募集泛素化的 E2(Ubquitin-conjugating enzyme)中間體[15-16]。單亞基的RING finger E3泛素蛋白連接酶ARC1，在結合底物之后經U-box結構域與同源的E2相互作用，將底物泛素化，再由26S蛋白酶體降解，導致自交不親和反應的發生。

沙田柚屬于蕓香科配子體高度自交不親和果樹。目前，沙田柚自交不親和的細胞學、形態學以及蛋白質化學等方面的研究取得一定進展：沙田柚屬于配子體自交不親和類型，花柱的1/2左右為花粉管生長抑制部位[17]；分離和鑒定了沙田柚自交花柱[18]和花粉管中的特異蛋白[19]；對花柱通道細胞中的特異蛋白和花粉管中特異蛋白產生部位以及分布位置進行了確認[20-21]。為了進一步探討沙田柚自交不親和的機理，本文對自交和異交花柱進行了轉錄組測序，通過對自交和異交花柱差異基因的比對，獲得了沙田柚RING finger 基因，并對該基因編碼的蛋白質進行了生物化學特征分析，旨在為沙田柚自交不親和分子機理的深入研究提供幫助。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

沙田柚實驗材料采自廣西靈川縣潮田鄉大山口村果園10年生結果樹。在盛花期對沙田柚樣樹進行人工自交(沙田柚×沙田柚)授粉和異交授粉(酸柚×沙田柚)，分別收集自交和異交1～3 d的授粉花柱以及當天未開花的花柱，立即放入液氮中保存，并放入-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取、建庫和測序

總RNA提取采用了改良的Trizol法[22]，檢測合格的RNA交由深圳華大基因科技服務有限公司進行建庫和測序。建庫和測序的程序和方法詳見文獻[23]。

1.2.2 序列分析和系統樹構建

使用DNAman、ORF Finder、TMPRED、Phyre2、NetPhos2.0等軟件對序列以及蛋白質理化性質進行分析，使用DNAman軟件對氨基酸序列RING-H2 finger蛋白的系統進化樹進行構樹。

1.2.3 基因表達量及差異統計

使用RPKM法(Reads per kb per million reads)，即每百萬resd中來自某一基因每千堿基長度的resd數目計算基因表達量。如果一個基因存在多個轉錄本，則用該基因的最長轉錄本計算其測序覆蓋度和表達量。根據基因的表達量(RPKM值)計算該基因在不同樣本間差異表達倍數。FDR(false discovery rate)值越小，異倍數越大，表明表達差異越顯著。本文確定FDR≤0.001 且差異表達倍數不低于 2 倍(log 2Ratio≥1)的條件對自交和異交花柱之間的基因進行差異表達統計。自交/異交1 d花柱之間的差異表達基因為3 467個，自交/異交2花柱之間的差異基因為3 460個，自交/異交3 d花柱之間的差異表達基因數量為3 609個。分別將這些差異基因序列比對到NR、NT、Swiss-Port、COG等數據庫中，得到差異基因編碼蛋白的功能。其中Unigene20689_All定于為RING finger蛋白基因。

2 結果與分析

2.1 基因的生物信息學分析

沙田柚RING finger蛋白(Unigene20689_All)的基因組序列全長為845 bp (GenBank登錄號：KY885238)。通過生物信息學軟件DNAman以及NCBI網站上的NCBI ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)對序列進行分析，該序列的開放閱讀框共有387 bp，編碼128個氨基酸, 如圖1所示。

圖1 RING-H2 finger蛋白基因序列和推測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of RING-H2 finger protein gene and the deduced amino sequence

2.2 功能結構域分析

運用NCBI上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 因編碼的氨基酸進行分析，該蛋白質具有一個與RING finger superfamily蛋白相同的保守結構域, 如圖2所示。

圖2 RING-H2 finger superfamily蛋白保守結構域Fig.2 Conserved domains of porcine RING-H2 finger superfamily protein

2.3 編碼蛋白質的分析和疏水性預測

運用在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對該蛋白質進行分析該蛋白質的分子量為13.61 KDa，等電點pI為4.26，分子式為C577H919N155O196S14，不穩定系數為45.90，屬于不穩定蛋白。其中，該蛋白質攜帶的負電荷氨基酸(Asp + Glu)總數為15，正電荷氨基酸(Arg + Lys)總數為6。蛋白質疏水性分析結果如圖3所示，從圖3中可以看出該基因編碼的肽鏈中疏水性最大值約為2.96，最小值約為-3.65，初步鑒定該蛋白質為疏水蛋白。

圖3 RING-H2 finger蛋白疏水性分析Fig.3 Hydrophobicity Analysing of RING-H2 finger protein

2.4 跨膜預測

運用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/) 對RING finger蛋白的跨膜區域進行預測。結果表明不屬于跨膜蛋白，如圖4所示。

圖4 RING-H2 finger蛋白的跨膜區預測Fig.4 Result of TMpred prediction on RING-H2 finger protein

2.5 蛋白質二級以及三級結構的預測

運用在線分析軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)對RING finger蛋白二級結構進行預測，預測結果如圖5所示。結果表明該蛋白的α-螺旋所占比例為10.94%，延伸鏈為34.38%，β-轉角為7.03%，無規則卷曲為47.66%。

圖5 RING-H2 finger 蛋白的二級結構預測Fig.5 The secondary structure prediction of RING-H2 finger protein

注：h:α-螺旋；t:β-轉角；c為無規則卷曲；e為延伸鏈.

利用在線軟件Phyre2[24]對RING finger蛋白氨基酸序列進行三級結構進行預測，結構如圖6所示。結果顯示，以c5dOkI結構為模板，蛋白128個氨基酸序列中有64個氨基酸與模板達到99.7%的可信度。

2.6 同源序列比對和系統發育

沙田柚Unigene20689_All序列與甜橙數據庫(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)的RING-H2 finger蛋白(Cs4g15340.1)的cDNA相似度為98%。再從NCBI下載其他9種植物的RING-H2 finger基因編碼的氨基酸序列，利用DNAMan構建系統發育樹，結果表明沙田柚RING finger基因編碼的蛋白質與蕓香科的甜橙(Citrussinensis)有很近的親緣關系，屬于同一進化分支，如圖7所示。經過同源性比較，在氨基酸的N端具有一個RING-H2 finger蛋白的保守結構域，推測沙田柚Unigene20689_All基因編碼的蛋白質是RING-H2 finger蛋白。

圖6 RING-H2 finger蛋白的三級結構Fig.6 The tertiary structure of RING-H2 finger protein

圖7 10種植物RING-H2 finger蛋白的氨基酸序列比較Fig.7 The comparison plant on amino acid sequence RING-H2 finger protein of 10 plant species

注：Unigene 20689(沙田柚, KY885228 ),Arabidopsisthaliana(擬南芥，NP_178507.1,)，Citrussinensis(甜橙，Cs4g15340.1)，Eutremahalophilum(山俞菜，AAM19707.1),Heveabrasiliensis(橡膠樹，AAP46154.1)，Medicagotruncatula(蒺藜苜蓿，XP_003601512.1)，Ricinuscommunis(蓖麻，XP_002533895.1)，Solanumlycopersicum(番茄，XP_004251547.1)，Solanumnigrum(龍葵，ADW66146.1),Zeamays(玉米，DAA40340.1).

3 討 論

26S泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway)是已知真核生物中主要的蛋白質降解途徑，主要由泛素(Ub)、泛素激活酶(E1)、泛素結合酶(E2)、泛素蛋白連接酶(E3)和26S蛋白酶體組成[25],其中，泛素連接酶 E3 在底物的特異性選擇降解過程中發揮關鍵作用。根據其結構和功能，目前已經發現的E3 可以分為2大類：HECT結構域E3和RING E3。RING E3泛素連接酶具有一個RING finger域或一個與RING finger在結構上相關的U-box域，如SCF、ARC1等。

26S泛素蛋白酶體途徑的生物學功能廣泛，在植物的生長發育、抗病反應、激素反應、脅迫反應中起著重要的作用。此外，泛素/蛋白酶體途徑與高等植物的有性生殖有關。Callis等[26]發現玉米花粉成熟時，其游離泛素和泛素綴合蛋白的含量都急劇下降，分別只有早期單核小孢子中的1/10 和1/50。Kulikauskas等[27]發現一些禾本科植物花粉成熟時伴隨著游離泛素水平的顯著下降，而其他植物的花粉成熟時都具有高水平的游離泛素這一特征。Li等[28]發現泛素及泛素綴合蛋白在Nicotianaalata雌雄蕊中的分布具有時間、組織特異性，并認為泛素系統對高等植物生殖結構的分化過程起調節作用。同時，泛素/蛋白酶體途徑在Actinidiadeliciosa花粉萌發過程中起重要作用，并參與建立并維持Actinidiadeliciosa花粉管的極性生長模式[29-30]。此外，26S泛素蛋白酶體途徑還與植物自交不親和相關。Qiao等[31]認為而在不親和授粉中，花粉受體分子為SLF(S-locus-encoded F-box proteins)，它含有一個F-box結構域SLF與S-RNase以等位基因特異性形式結合，這樣就不會形成SCF復合體，S-RNase的核酸酶活性就會被保持下來，從而降解花粉管中的RNA，使花粉管停止生長，最終導致自交不親和反應。

4 結 論

本文克隆的Unigene20689_All序列與甜橙的RING-H2 finger基因編碼的氨基酸序列的相似度為98%，通過與其他含有RING-H2 finger結構域的植物進行同源性比對，其在C-端含有一個RING-H2 finger保守結構域，說明Unigene20689_All序列為RING-H2 finger基因。推測該基因可能在沙田柚泛素調節的蛋白質降解途徑中扮演識別底物的角色，但在沙田柚自交不親和反應中的具體功能還有待進一步研究。

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BioinformaticsanalysisofRING-H2fingergenefromCitrusgrandisvar.ShatianyuHort

LI Huimin, LUO Qiong, XIAO Jun, LI Shaomei, LIU Huaying, QIN Xinmin*

(CollegeofLifeScience,GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,Guangxi，China)

To explore the molecular mechanism of self-incompatibility，the transcriptomes of the self-pollinated style and cross-pollinated style ofCitrusgrandisvar.ShatinyuHort were sequenced by high-throughput sequencing technology. RING-H2 finger gene sequence ofCitrusgrandisvar.ShatinyuHort was obtained through differential analysis method, and some characters of the RING-H2 finger protein were analyzed and predicted by bioinformatics method, including the composition of amino acid sequence, physicochemical parameters, hydrophobicity, transmembrane domain, structure and function of protein etc. The results showed that RING-H2 finger gene was 845 bp in length with an open reading frame(ORF) of 387 bp, encoding 128 amino acids with deduced molecular weight of 13.61 KDa, and theoretical pI value of 4.26, and contained a RING-H2 finger domain. Bioinformatics analysis showed that RING-H2 finger protein was a hydrophobic and unstable protein. The homology analysis of amino acid sequence indicated that the RING-H2 finger protein shared high similarity with RING-H2 finger protein ofCitrussinensisCs4g15340.1 (98%).This work will provide the useful reference for further investigation of the structure and function of the RING-H2 finger protein．

Citrusgrandisvar.ShatinyuHort; RING-H2 finger protein gene; bioinformatics;RING finger domain

S576

A

1672-5565(2017)03-149-07

10.3969/j.issn.1672-5565.201701005

2017-01-20;

2017-05-04.

國家自然科學基金(31360477)；廣西高校科研項目(2013YB036).

李惠敏，女，副教授,研究方向：植物分子生物學；E-mail：75727614@qq.com.

*通信作者： 秦新民，男，博士，教授，研究方向：植物分子生物學；E-mail：xmqin@mailbox.gxnu.edu.cn.