FTY720對蛛網膜下腔出血大鼠神經功能的作用及機制

董曉巧 俞文華 杜權 王昊 楊定博 沈永鋒 江力 胡強 杜垣鋒 朱強 車志豪 孫承龍 劉群杰 王鼎

●論 著

FTY720對蛛網膜下腔出血大鼠神經功能的作用及機制

董曉巧 俞文華 杜權 王昊 楊定博 沈永鋒 江力 胡強 杜垣鋒 朱強 車志豪 孫承龍 劉群杰 王鼎

目的 探討FTY720對蛛網膜下腔出血大鼠神經功能的作用及相關機制。方法 將96只大鼠隨機分成正常組、假手術組、模型組和治療組，每組24只，采用枕大池二次注血建立蛛網膜下腔出血大鼠模型。治療組按1mg/kg腹腔注射FTY720，其他3組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1ml。24h后每組取12只斷頭處死并分離海馬組織，采用Western blot法檢測NF-κB蛋白表達，采用免疫組化染色法檢測小膠質細胞OX-42蛋白表達；每組剩余12只大鼠用于神經功能評估。結果 模型組大鼠海馬組織NF-κB蛋白表達水平、小膠質細胞OX-42蛋白表達水平均較正常組、假手術組明顯增加（均P＜0.05），治療組較模型組明顯減少（P＜0.05）。前肢放置實驗評分、平衡實驗評分和改良神經功能缺損程度評分術后7、14、21、28d比較，治療組較模型組均明顯下降（均P＜0.05）。結論 FTY720可改善蛛網膜下腔出血大鼠神經功能，其作用機制可能與FTY720的中樞炎癥抑制作用有關。

FTY720 大鼠 蛛網膜下腔出血 神經功能 炎癥反應 腦保護作用

蛛網膜下腔出血誘發的免疫反應可繼發腦損傷，嚴重影響患者預后[1-2]。FTY720是一種新型的免疫抑制劑，系冬蟲夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-I作結構改造而成，對人體的免疫功能具有雙向調節作用，即在體內抑制免疫反應發生的同時，又不破壞機體對病毒的免疫應答及免疫記憶能力，不良反應少，生物利用度高[3]。因此，目前FTY720廣泛用于多發性硬化癥、器官移植等免疫性疾病的治療，它有望成為新一代免疫抑制劑[4-7]。本研究通過建立大鼠蛛網膜下腔出血模型并腹腔注射FTY720，觀察其對大鼠神經功能的保護作用，并檢測海馬組織炎癥因子（NF-κB、OX-42）的變化，以探討這一作用的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 FTY720（批號：SML0700；規格：25mg）購自美國Sigma公司；二辛可寧酸法（BCA）蛋白定量試劑盒（批號：23229）購自美國Thermo Scientific公司；Tris 0.9%氯化鈉溶液和吐溫20緩沖液（TBST，批號：117087）均購自上海經科化學科技有限公司；化學發光（ECL）試劑盒（批號：K820-50）購自武漢艾美捷科技有限公司；卵白素-生物素-酶復合物染色（ABC）復合物抗體（批號：PK-6100）購自上海翊圣生物科技有限公

司；轉印槽（型號：Trans-Blot）購自美國Biorad公司；電泳儀（型號：EPS-200）購自上海天能科技有限公司；小型垂直電泳槽（型號：164-8001）購自美國Biorad公司；脫色搖床（型號：TY-80B）購自常州澳華儀器有限公司；生物倒置顯微鏡（型號：IX-71）購自中國奧林巴斯有限公司；低溫高速離心機（型號：BECKMAN）購自北京普瑞麥迪實驗室技術有限公司；熒光分光光度儀（型號：UV-1202）購自日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及造模 將96只健康Wistar大鼠（雄性，清潔級，由南京大學模式動物研究所提供）隨機分成正常組、假手術組、模型組和治療組，每組24只。按50mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，采用Roux等[8]建立的枕大池二次注血法制作蛛網膜下腔出血大鼠模型，假手術組兩次注入等量0.9%氯化鈉溶液。治療組大鼠模型形成前0.5h按1mg/kg腹腔注射FTY720，其他3組大鼠均予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1ml。24h后每組取12只大鼠，按80mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉，斷頭處死，分離海馬組織；每組剩余12只大鼠用于神經功能評估。正常組、假手術組、模型組和治療組24h分別死亡0、2、4和3只，4組大鼠死亡率比較差異無統計學意義（PP＞0.05）；大鼠死亡后補充成活大鼠，以保證每組24只大鼠。

1.2.2 Western blot檢測NF-κB蛋白表達水平 取部分海馬組織按1∶10（密度∶體積）加入細胞裂解液，冰上勻漿，13 000g離心20min，收集上清液；采用BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白（50μg）經12%SDS-PAGE電泳后，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST室溫封閉1h；加入相應兔抗大鼠 NF-κB 單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室溫搖床孵育 1h，TBST 洗膜 3 次；ECL試劑作用5min，X線膠片曝光。沖洗并掃描后結果用Quality one軟件分析雜交條帶灰度值，以GAPDH水平為內對照，計算相對灰度值，即NF-κB蛋白表達水平。1.2.3 免疫組化染色法檢測小膠質細胞OX-42蛋白表達 取部分海馬組織，采用ABC法進行OX-42免疫組化染色。按常規方法將海馬組織制作蠟塊，切片，貼片，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；依次加入0.3%過氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01mol PBS 100ml＋30%過氧化氫）、0.3%Triton X-100（0.3ml Triton X-100＋0.01mol PBS 100ml）、血清稀釋液（牛血清白蛋白 1g＋0.01mol PBS 100ml＋疊氮鈉 0.08g）稀釋的一抗、0.01mol PBS稀釋的的二抗和ABC復合物抗體，每次予以0.01mol PBS清洗，最后蒸餾水迅速沖洗，加入顯色液，進行免疫組化顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，透明，封片，拍照。利用細胞計數軟件系統進行細胞立體測量計數，以正常組計數細胞值100為對照，計算相對表達值，即小膠質細胞OX-42蛋白表達水平。

1.2.4 動物行為測試 參照Kawamata等[9]的前肢放置試驗和平衡試驗方法，在術后 1、3、7、14、21、28d 對大鼠進行前肢放置試驗和平衡試驗評分測定，前肢放置試驗得分0～10分，平衡試驗得分1～7分；得分越高表示神經功能損傷越嚴重。

1.2.5 改良神經功能缺損程度評分測定 參考Chen等[10]的方法，在術后 1、3、7、14、21、28d 對大鼠進行改良神經功能缺損程度評分測定，包括運動、感覺、反射和平衡試驗，得分0～18分；得分越高表示神經功能損傷越嚴重。1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FTY720對NF-κB蛋白表達的影響 正常組、假手術組、模型組和治療組大鼠海馬組織NF-κB蛋白表達 水 平 分 別 為 100.0±5.2、102.2±7.0、263.8±21.9 和171.6±21.2，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中正常組與假手術組比較差異無統計學意義（PP＞0.05），模型組較正常組、假手術組均明顯增加（均P＜0.05），治療組較模型組明顯減少（P＜0.05），見圖1-2。

圖1 4組大鼠海馬組織NF-κB蛋白表達的電泳圖

圖2 4組大鼠海馬組織NF-κB蛋白表達水平的比較

2.2 FTY720對小膠質細胞OX-42蛋白表達的影響 正常組、假手術組、模型組和治療組大鼠小膠質細胞OX-42 蛋白表達水平為 100.0±15.5、98.6±15.4、299.2±36.9和192.1±30.8，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中正常組與假手術組比較差異無統計學意義（PP＞0.05），模型組較正常組、假手術組均明顯增加（均P＜0.05），治療組較模型組明顯減少（P＜0.05），見圖3-4。

圖3 4組大鼠海馬組織小膠質細胞OX-42免疫組化染色結果（×20）

圖4 4組大鼠海馬組織小膠質細胞OX-42蛋白表達的比較

2.3 FTY720對大鼠運動功能的影響 正常組、假手術組大鼠前肢放置試驗評分均為0分（最低分），平衡實驗評分均為1分（最低分）。因此對模型組與治療組前肢放置試驗評分、平衡實驗評分進行比較，發現術后1、3d差異均無統計學意義（均 P ＞0.05）；術后 7、14、21、28d，治療組較模型組均明顯下降（均P＜0.05），見表1。

2.4 FTY720對大鼠改良神經功能缺損程度評分的影響 正常組、假手術組大鼠改良神經功能缺損程度評分均為0分（最低分）。因此對模型組與治療組改良神經功能缺損程度評分進行比較，發現術后1、3d差異均無統計學意義（均 P ＞0.05）；術后 7、14、21、28d，治療組較模型組均明顯下降（均P＜0.05），見表2。

FTY720是一種新型的免疫抑制劑，將冬蟲夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-I進行結構改造而成，屬于鞘氨醇-1-磷酸鹽受體阻滯劑[5]。FTY720在

表1 模型組與治療組大鼠術后各時點運動功能的比較（分）

3 討論

蛛網膜下腔出血是腦動脈瘤破裂最常見的表現，出血導致的早期腦損傷會影響患者的預后[9-10]。免疫反應是繼發性腦損傷病理生理機制的重要組成部分，也參與蛛網膜下腔出血繼發的早期腦損傷過程；腦組織局部免疫反應增強會加重腦組織的繼發性腦損傷[1-2]，為臨床應用免疫抑制劑治療蛛網膜下腔出血早期腦損傷提供一定的實驗依據。但臨床常規免疫抑制劑可導致全身免疫功能降低，繼發感染。因此，尋找一種安全有效的免疫抑制劑對于降低蛛網膜下腔出血早期腦損傷具有重要意義。體外以無活性的形式存在，在體內經鞘氨醇激酶2磷酸化為具有生物活性的（S）-FTY720-P異構體而發揮作用。FTY720主要用于抑制器官移植所引起的排斥反應，還可以用于治療皮炎、重癥肌無力等免疫紊亂或障礙疾病以及某些轉移性癌癥[3-7]。小膠質細胞在中樞神經系統扮演炎癥細胞的角色。當腦組織受到外傷、缺血及缺氧等損害時，小膠質細胞增生活躍，包括NF-κB在內的諸多NF表達上調；通過不同信號途徑與DNA結合，使IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子分泌增加，進而損傷神經細胞，影響神經功能[11-13]。OX-42是小膠質細胞特異性的表達蛋白，OX-42表達能反映小膠質細胞增生活躍程度，也能間接反映中樞神經系統炎癥反應的程度[14]。目前動物實驗選擇1mg/kg FTY720腹腔或靜脈注射治療腦損傷[16-17]。本研究結果顯示大鼠蛛網膜下腔出血后海馬組織NF-κB、小膠質細胞OX-42蛋白表達均明顯增加，給予FTY720處理后出現不同程度的下調，提示FTY720可降低蛛網膜下腔出血后的炎癥反應。既往研究表明FTY720可抑制體外培養膠質細胞的炎性因子釋放[15]，阻止腦外傷大鼠外傷皮層炎性細胞的聚集[16]，抑制動物腦出血后腦內淋巴細胞的浸潤[17]；以上研究結果均說明FTY720對中樞神經系統的炎癥反應具有明顯抑制作用。

表2 模型組與治療組大鼠術后各時點改良神經功能缺損程度評分的比較（分）

目前關于FTY720改善腦損傷功能的研究較少。為評價FTY720對蛛網膜下腔出血大鼠神經功能的影響，本研究采用前肢放置實驗、平衡實驗和改良神經功能缺損程度評分，以綜合反映蛛網膜下腔出血大鼠的運動、感覺及協調功能。研究結果提示FTY720可明顯降低蛛網膜下腔出血大鼠前肢放置實驗、平衡實驗和改良神經功能缺損程度評分。既往研究表明FTY720能有效抑制短暫性腦缺血導致的大鼠神經細胞死亡[18]，降低腦出血大鼠腦水腫并改善腦功能[19]。因此，筆者推測FTY720可能通過抑制腦炎癥反應，改善蛛網膜下腔出血導致的大鼠神經功能障礙；但本研究未深入分析FTY720治療大鼠蛛網膜下腔出血的藥物劑量與療效的關系，有待進一步研究。

[1] Lee C I,Chou A K,Lin C C,et al.Immune and inflammatory gene signature in rat cerebrum in subarachnoid hemorrhage with microarray analysis[J].MolMed Rep,2012,5(1):118-125.

[2] Ayer R E,Ostrowski R P,Sugawara T,et al.Statin-induced T-lymphocyte modulation and neuroprotection following experimentalsubarachnoid hemorrhage[J].Acta Neurochir Suppl,2013,115:259-266.

[3]Pitman M R,Woodcock J M,Lopez A F,et al.Molecular targets of FTY720(fingolimod)[J].Curr MolMed,2012,12(10):1207-1219.

[4] Patmanathan S N,Yap L F,Murray P G,et al.The antineoplastic properties of FTY720:evidence for the repurposing of fingolimod[J].J CellMolMed,2015,19(10):2329-2340.

[5]Zhang L,Wang H D,Ji XJ,et al.FTY720 for cancer therapy(Review)[J].OncolRep,2013,30(6):2571-2578.

[6] Estella-Hermoso de Mendoza A,Castello-Cros R,Imbuluzqueta E,et al.Lipid nanosystems enhance the bioavailability and the therapeutic efficacy of FTY720 in acute myeloid leukemia[J].J Biomed Nanotechnol,2015,11(4):691-701.

[7] Yoshida Y,Tsuji T,Watanabe S,et al.Efficacy of combination treatment with fingolimod (FTY720)plus pathogenic autoantigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide(GPI325-339)-induced arthritis mouse model[J].Biol Pharm Bull,2013,36(11):1739-1746.

[8] Roux S,Lo ffler B M,Gray G A,et al.The role of endothelin in experimentalcerebralvasospasm[J].Neurosurgery,1995,37(1):78-85.

[9] Kawamata T,Dietrich W D,Schallert T,et al.Intracisternal basic fibroblastgrowth factorenhances functional recovery and up-regulates the expression of a molecular marker of neuronal sprouting following focalcerebralinfarction[J].Proc NatlAcad Sci USA,1997,94(15):8179-8184.

[10] Chen J,Li Y,Wang L,et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J].Stroke,2001,32(4):1005-1011.

[11] Hinson H E,Rowell S,Schreiber M.Clinical evidence of inflammation driving secondary brain injury:A systematic review[J].J Trauma Acute Care Surg,2015,78(1):184-191.

[12] Abdul-Muneer P M,Schuetz H,Wang F,et al.Induction of oxidative and nitrosative damage leads to cerebrovascular inflammation in animal model of mild traumatic brain injury induced by primary blast[J].Free Radic Biol Med,2013,60(2):282-291.

[13] Dong X Q,Du Q,Yu W H,et al.Anti-inflammatory effects of oxymatrine through inhibition of nuclear factor-kappa B and mitogen-activated protein kinase activation in lipopolysaccharide-induced BV2 microglia cells[J].Iran J Pharm Res,2013,12(1):165-174.

[14] Ghosh M,Garcia-Castillo D,Aguirre V,et al.Pro-inflammatory cytokine regulation of cyclic AMP-phosphodiesterase 4 signaling in microglia in vitro and following CNS injury[J].Glia,2012,60(12):1839-1859.

[15] Janssen S,Schlegel C,Gudi V,et al.Effect of FTY720-phosphate on the expression of inflammation-associated molecules in astrocytes in vitro[J].MolMed Rep,2015,12(4):6171-6177.

[16] Zhang Z Y,Zhang Z R,Fauser U,et al.FTY720 attenuates accumulation of EMAP-Ⅱ+and MHC-Ⅱ+monocytes in early lesions of rat traumatic brain injury[J].J CellMolMed,2007,11(2):307-314.

[17] Rolland WB,Lekic T,Krafft P R,et al.Fingolimod reduces cerebral lymphocyte infiltration in experimental models of rodent intracerebralhemorrhage[J].Exp Neurol,2013,241(1):45-55.

[18] Hasegawa Y,Suzuki H,Sozen T,et al.Activation of sphingosine 1-phosphate receptor-1 by FTY720 is neuroprotective after ischemic stroke in rats[J].Stroke,2010,41(2):368-374.

[19] Rolland W B,Manaenko A,Lekic T,et al.FTY720 is neuroprotective and improves functional outcomes after intracerebral hemorrhage in mice[J].Acta Neurochir Suppl,2011,111(2):213-217.

Effect of FTY720 on neurological function in rats with subarachnoid hemorrhage and related mechanism

DONG Xiaoqiao,YU

Wenhua,DU Quan,et al.Department of Neurosurgery,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the effect of FTY720 on neurological function in rats with subarachnoid hemorrhage(SAH)and the related mechanism. Methods A total of 96 rats were randomly assigned to normal group,sham-operation group,model group and treatment group with 24 rats in each group.The rat SAH model was established via autologous blood injection into cisterna magna.Rats in treatment group were given intraperitoneally with 1mg/kg FTY720.Rats in other three groups were given intraperitoneal injection of 1ml normal saline.After 24 hours,12 rats in each group were sacrificed by decapitation and their hippocampus tissue samples were collected.Western blot was used to determine the expression of nuclear factor-kappa B(NF-κB).Immunohistochemistry was utilized to investigate the microglial OX-42 expression.Other 12 rats in each group experienced neurological function assessment. Results The relative expressions of NF-κB and microglial OX-42 in the hippocampus tissues were significantly higher in model group than those in normal group and sham-operation group (allP＜0.05),also higher than those in treatment group(allP＜0.05).Forelimb-placement test,balance test and modified neurological severity scores at d 7,14,21 and 28 postoperatively in treatment group were all significantly lower than those in model group(allP＜0.05). Conclusion FTY720 can markedly improve the neurological function of rats with SAH,which may be related to the inhibition of inflammation in central nervous system.

FTY720 RatSubarachnoid hemorrhage Neurologicalfunction Inflammation Cerebralprotective effect

2016-09-08）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2016-1373

浙江省實驗動物科技計劃項目（2015C37082）

310006 杭州市第一人民醫院（南京醫科大學附屬杭州醫院）神經外科

董曉巧，E-mail：dxqhyy@163.com