腦膠質瘤組織時鐘基因啟動子區甲基化狀態及意義

杜權 俞文華 董曉巧 朱強 車志豪 王昊 楊定博 沈永鋒 江力

腦膠質瘤組織時鐘基因啟動子區甲基化狀態及意義

杜權 俞文華 董曉巧 朱強 車志豪 王昊 楊定博 沈永鋒 江力

目的 探討腦膠質瘤組織中PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1和NPAS2時鐘基因啟動子區甲基化狀態與腦膠質瘤發生、發展的關系。方法 采用甲基化特異性PCR檢測腦膠質瘤組織及其癌旁正常組織（對照）PER1、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1、NPAS2等時鐘基因啟動子區甲基化狀態。結果 腦膠質瘤組織與癌旁正常組織中PER1、CLOCK時鐘基因啟動子區均未有甲基化；腦膠質瘤組織中NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區甲基化頻率明顯高于癌旁正常組織（均P＜0.05）；兩種組織中CRY1、CRY2和BMAL1時鐘基因啟動子區甲基化頻率比較，差異均無統計學意義（均PP＞0.05）。不同級別腦膠質瘤組織中PER1、CLOCK時鐘基因啟動子區均未有甲基化；高級別腦膠質瘤（Ⅲ～Ⅳ級）組織中NPAS2時鐘基因啟動子區甲基化頻率高于低級別膠質瘤（Ⅰ～Ⅱ級）組織（P＜0.05）；不同級別腦膠質瘤組織中CRY1、CRY2、BMAL1和PER2時鐘基因啟動子區甲基化頻率比較，差異均無統計學意義（均PP＞0.05）。結論 NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區甲基化頻率明顯增高；NPAS2時鐘基因啟動子區甲基化頻率越高，腦膠質瘤的惡性程度越高。NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區DNA甲基化修飾可能是腦膠質瘤發生、發展的重要機制。

腦膠質瘤 啟動子區 甲基化 時鐘基因

晝夜節律是自然界所有生物體具有的特征，晝夜節律系統受時鐘基因所編碼的蛋白質調節[1-2]。研究發現，時鐘基因功能紊亂與腫瘤的發生、發展密切相關[3]。而基因啟動子區甲基化可以改變目的基因的表達狀態，從而影響膠質瘤的生長[4]。新近的研究已證實PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1 和 NPAS2 等時鐘基因啟動子區甲基化與胃癌、肝癌、乳癌等惡性腫瘤的發生、發展密切相關[5-7]。筆者就腦膠質瘤以上時鐘基因啟動子區甲基化狀態進行了研究，并探討這些變化與腦膠質瘤發生、發展的關系，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2005年6月至2010年6月在本院神經外科手術治療的102例初發腦膠質瘤患者為研究對象。其中男63例，女39例；年齡≤60歲60例，＞60歲42例；WHO分級：Ⅰ～Ⅱ級49例，Ⅲ～Ⅳ級53例；腫瘤部位：幕上86例，幕下16例；腫瘤類型：星形細胞瘤68例，其他34例；腫瘤直徑：≤5cm 70例，＞5cm 32例；術前卡氏功能狀態評分（KPS）：≥80分42例，＜80分60例。其中腫瘤全部切除72例；術后化療56例，術后放療77例。所有患者為漢族人，均未合并其他惡性腫瘤，直系親屬均排除膠質瘤病史。

1.2 方法 術中收集腦膠質瘤組織及其癌旁正常組織（對照），采用甲基化特異性PCR檢測PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1 和 NPAS2 等時鐘基因啟動子區甲基化狀態。使用DNA組織提取試劑盒（產品規格250次，批號Z3105，由美國Promega公司提供）提取腫瘤組織及正常腦組織的基因組DNA，使用甲基化特異性PCR試劑盒（產品規格60次，批號EM101，由美國Millipore公司提供）對基因組DNA進行亞硫酸氫鈉修飾，修飾后的DNA進行PCR擴增，時鐘基因的引物參照文獻[8]，產物于4%瓊脂糖凝膠上進行電泳，在紫外儀下觀察并記錄結果。為了確定甲基化特異性和PCR特異性，以甲基轉移酶處理的基因組DNA作為陽性對照、未經處理的基因組DNA作為陰性對照。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦膠質瘤組織與癌旁正常組織中時鐘基因啟動子區甲基化頻率的比較 腦膠質瘤組織與癌旁正常組織中PER1、CLOCK時鐘基因啟動子區均未有甲基化；腦膠質瘤組織中NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區甲基化頻率明顯高于癌旁正常組織（均P＜0.05）；兩種組織中CRY1、CRY2和BMAL1時鐘基因啟動子區甲基化頻率比較，差異均無統計學意義（均PP＞0.05），見表1。

表1 腦膠質瘤患者與癌旁正常組織中時鐘基因啟動子區甲基化頻率的比較[例（%）]

2.2 不同級別腦膠質瘤組織中時鐘基因啟動子區甲基化頻率的比較 不同級別腦膠質瘤組織中PER1、CLOCK時鐘基因啟動子區均未有甲基化；高級別腦膠質瘤（Ⅲ～Ⅳ級）組織中NPAS2時鐘基因啟動子區甲基化頻率高于低級別膠質瘤（Ⅰ～Ⅱ級）組織（P＜0.05）；不同級別腦膠質瘤組織中CRY1、CRY2、BMAL1和PER2時鐘基因啟動子區甲基化頻率比較，差異均無統計學意義（均PP＞0.05），見表 2。

表2 不同級別腦膠質瘤組織中時鐘基因啟動子區甲基化頻率的比較[例（%）]

3 討論

自然界所有動植物在白天、黑夜會呈現出不同的生理特征。晝夜節律系統調節人體24h有序的生理過程，從而保持機體與自然界和諧共存。晝夜節律系統由一系列時鐘基因表達的蛋白來調節，這些蛋白不僅是正常生理所必需的，也參與了激素分泌、細胞代謝、生長和凋亡等過程[1-3]。有研究認為晝夜節律系統的紊亂與腫瘤的發生、發展有著密切關系，而時鐘基因功能改變在其中發揮著重要作用[3]。基因啟動子區甲基化是改變基因表達能力的重要方式[4]。PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1和NPAS2等時鐘基因啟動子區甲基化與一些惡性腫瘤的發生、發展相關。相關研究證實某些時鐘基因可能通過復雜的網絡調節系統，最終影響腫瘤的增生或凋亡[5-7]。

PER1、PER2均是抑癌基因。Xia等[9]研究結果顯示腦膠質瘤組織中PER1、PER2時鐘基因啟動子區甲基化頻率較癌旁正常組織明顯降低，但與腦膠質瘤組織的WHO分級無關。放療可以明顯增加膠質瘤細胞PER1、PER2表達；因此，PER1、PER2表達被認為具有放療、增敏作用[10]。本研究結果發現，腦膠質瘤組織及其癌旁正常組織中PER1時鐘基因啟動子區為非甲基化；而PER2時鐘基因啟動子區有低頻率甲基化，且腦膠質瘤組織中PER2時鐘基因啟動子區甲基化頻率明顯高于癌旁正常組織，但與腫瘤惡性程度未見相關性。以上結果提示，基因啟動子區甲基化可能不是腦膠質瘤細胞PER1表達的表觀遺傳學調控機制，同時腦膠質瘤細胞PER2表達也不完全受基因甲基化所控制。時鐘基因CRY1、CRY2的確切作用目前尚未明確。有研究結果顯示這2個基因的異常表達會影響時鐘基因PER1、PER2的功能。Luo等[11]研究結果顯示腦膠質瘤組織中CRY1、CRY2表達較癌旁正常組織明顯下調，但與腦膠質瘤WHO分級無關。本研究發現，腦膠質瘤組織及其癌旁正常組織中均有低頻率的CRY1、CRY2時鐘基因啟動子區甲基化，但兩種組織比較差異均無統計學意義。因此，腦膠質瘤細胞CRY1、CRY2蛋白的表達也可能受到其他因素的影響。CLOCK、BMAL1時鐘基因是哺乳動物生命活動中重要的2個中央時鐘元件，它們在腫瘤細胞的增殖、凋亡、生長代謝、治療等方面發揮著重要作用。人類腦膠質瘤組織CLOCK時鐘基因表達明顯增高，而在高級別膠質瘤組織中該基因的表達更為明顯[12]。體外抑制CLOCK時鐘基因表達可以促進體外培養人類膠質瘤細胞的凋亡[13]。而BMAL1時鐘基因的作用相反，它能夠抑制體外培養的膠質瘤細胞生長，發揮腫瘤抑制因子的作用[14]。本研究結果顯示，腦膠質瘤組織與癌旁正常組織中CLOCK時鐘基因啟動子區均未有甲基化；BMAL1時鐘基因啟動子區雖有甲基化，但兩種組織比較差異無統計學意義。這說明基因啟動子區甲基化可能不是腦膠質瘤細胞CLOCK、BMAL1表達的表觀遺傳學調控機制。NPAS2是晝夜節律系統中重要的時鐘基因，是腫瘤抑制基因。NPAS2的表達與乳腺癌、肝癌、直腸癌、結腸癌的病理分級及預后密切相關[5-7]。高級別膠質瘤NPAS2表達明顯下降，NPAS2高表達膠質瘤患者生存期明顯延長[15]。本研究結果發現，腦膠質瘤組織及其癌旁正常組織中NPAS2時鐘基因啟動子區存有甲基化，而在腦膠質瘤組織中甲基化頻率明顯升高；同時還發現，腦膠質瘤組織WHO分級越高，NPAS2時鐘基因啟動子區甲基化頻率越高。以上研究結果說明，NPAS2基因啟動子區甲基化可能是腦膠質瘤發生的原因之一。

綜上所述，腦膠質瘤患者時鐘基因的異常表達可能與時鐘基因啟動子區甲基化的改變有關。NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區甲基化頻率明顯增高；NPAS2時鐘基因啟動子區甲基化頻率越高，腦膠質瘤的惡性程度越高。NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區DNA甲基化修飾可能是腦膠質瘤發生、發展的重要機制。

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Methylation status of clock gene promoter region in glioma patients

DU Quan,YU Wenhua,DONG Xiaoqiao,et al.Department of

Neurosurgery,Hangzhou First People's Hospital,Nanjing Medical University,Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the methylation status of PER1,PER2,CRY1,CRY2,CLOCK,BMAL1 and NPAS2 gene promoter regions in glioma tissues and its clinical significance. Methods The frequencies of methylation of PER1,PER2,CRY1,CRY2,CLOCK,BMAL1 and NPAS2 gene promoters were determined in glioma tissues and in surrounding non-glioma tissues (control group)were detected by methylation-specific PCR method. Results PER1 and CLOCK genes were devoid of methylation in promoter region.Differences in the promoter methylation frequencies of CRY1,CRY2 and BMAL1 genes between glioma and control group were not significant(PP＞0.05).Promoter methylation frequencies of NPAS2 and PER2 genes were significantly were elevated in glioma tissue compared to control group(P＜0.05),and moreover,promoter methylation frequency of NPAS2 was enhanced with increasing extent of malignancy(P＜0.05).Conclusion DNA-methylation modification in the promoter ofNPAS2 and PER2 genes may be an important mechanism underlying occurrence and development ofglioma.

Glioma PromoterMethylation Clock gene

2016-10-17）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2016-1656

浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2014KYA168）

310006 杭州市第一人民醫院（南京醫科大學附屬杭州醫院）神經外科

俞文華，E-mail：ywh699@126.com