二氫睪酮誘導小鼠雄激素性脫毛的機制研究

林蕾 楊夢潔 吳驍 王少敏 倪曙民 葉孟 高晶

二氫睪酮誘導小鼠雄激素性脫毛的機制研究

林蕾 楊夢潔 吳驍 王少敏 倪曙民 葉孟 高晶

目的 通過建立二氫睪酮（DHT）誘導的雄激素性脫毛（AGA）小鼠模型，研究DHT導致AGA發生、發展的相關分子機制。方法 采用DHT濃度梯度法對112只正常適齡雌性小鼠進行皮下給藥，并通過人工脫毛使小鼠毛發生長周期同步化。通過HE染色觀察DHT處理后不同時期小鼠毛囊形態結構及毛囊數目的改變，以確定AGA小鼠模型的建立。采用RT-PCR法對影響不同時期毛囊循環再生的相關信號分子的mRNA表達水平進行分析并比較。結果 不同濃度DHT處理后的小鼠在毛發生長不同階段均表現出典型的毛囊小型化和毛發稀疏。在整個毛發生長周期中雄激素受體（AR）的mRNA表達水平幾乎都呈上升趨勢，而在第40、48天呈下降趨勢。通過對毛囊干細胞表面標志物的mRNA表達水平分析發現，富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5（Lgr5）的mRNA表達水平在毛發生長期-休止期VI期之間呈下降趨勢，而CD34的mRNA表達水平無明顯變化。外源性增加DHT劑量，細胞內AR的mRNA表達水平也相應增加，促毛發生長因子如成纖維細胞生長因子受體（FGFR）、人胰島素樣生長因子結合蛋白-5（IGF-BP5）、Ptch1及Wnt信號相關蛋白的mRNA表達水平降低。結論 DHT處理后可成功誘導AGA小鼠模型。DHT能夠活化真皮乳頭細胞中的AR受體，與毛囊上皮細胞相互作用，對促毛發生長因子FGFR、IGF-BP5、Ptch1及Wnt信號相關蛋白的表達產生抑制作用。

二氫睪酮 雄激素受體 脫毛 模型 信號通路

1 材料和方法

1.1 實驗動物、分組及建模 SPF級C57BL/6雌性小鼠112只，5～6周齡，體重18～22g，購于江蘇常州卡文斯實驗動物有限公司[清潔級，編號：SCXK（蘇）2016-0010]，飼養于寧波大學實驗動物中心。飼養條件：25°C室溫，相對濕度 50%～70%，12h（7:00～19:00）明和 12h（19:00～7:00）暗條件下，每籠4只，不限飲食和水。根據預實驗結果，采用隨機數字表法將小鼠分為4組：對照組（玉米油給藥），實驗1組（DHT 5mg/kg給藥），實驗2組（DHT 7.5mg/kg給藥）和實驗3組（DHT 10mg/kg給藥），每組28只。DHT購于美國Sigma公司（批號521-18-6），玉米油購置中國阿拉丁公司（批號8001-30-7），濃度均配制為10mg/ml。分別每日于小鼠背部皮下注射給藥，給藥5d后對小鼠進行脫毛處理，脫毛處理后的小鼠繼續每日皮下給藥至指定天數，拍照記錄小鼠毛發生長狀況；至指定天數后對小鼠進行頸椎脫臼處死，以小鼠給藥點為中心剪取1cm3的全皮組織。組織樣品分成兩部分，一部分用包埋劑包埋凍存于-80°C，用于組織切片；另一部份用RNA樣品保存液處理后凍存于-80°C用于RT-PCR檢測。

1.2 小鼠毛囊形態結構觀察 將附有組織的載玻片至于-20°C冷甲醇溶液中固定30min。用雙蒸水（ddH2O）洗去載玻片上殘余的OCT，浸泡于蘇木素溶液中染色10min，ddH2O除去組織周圍殘余的染液，浸入1%氯化氫-乙醇分化液中分化15s，水洗后再浸入1%氨水中30s返藍，水洗并在伊紅染液中染色30s。水洗后進行乙醇濃度梯度脫水，然后置于二甲苯中進行透明處理30 min，用中性樹膠進行封片，晾干后在光學顯微鏡下觀察毛囊形態結構，并拍照記錄。

1.3 mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。（1）小鼠毛囊中已知AGA突變基因的mRNA表達水平，包括DHT 代謝的關鍵酶[5α-還原酶Ⅰ型（5alpha1）和 5α-還原酶Ⅱ型（5alpha2）]、AR；（2）小鼠皮膚中毛囊干細胞（HF-SC）活性標記物角蛋白K15、富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5（Lgr5）、CD34的mRNA表達水平；（3）小鼠毛囊中毛發生長相關因子如表皮生長因子受體（EGFR）、成纖維細胞生長因子受體（FGFR）、人胰島素樣生長因子結合蛋白-5（IGF-BP5）、血小板衍生因子α（PDGFRα）、Ptch1、轉化生長因子 β（TGF-β）、血管內皮生長因子受體（VEGFR）、Wnt信號相關蛋白的mRNA表達水平；（4）小鼠毛囊中細胞外基質（ECM）相關因子如層黏連蛋白 α1、α3和 α5（LMα1、LMα3和 LMα5）、膠原 α6（Collagen α6）、粘連蛋白（Fibronectin）、巢蛋白 1和2（Nidogen1和Nidogen2）的mRNA表達水平。利用引物設計軟件Primer Premier5.0進行引物設計，引物均由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。利用逆轉錄PCR將提取的總RNA以Oligo（dT）18為引物，反轉錄合成cDNA，用于后續實驗，所記錄的電泳圖用Image J軟件進行灰度值分析，讀取每個樣品基因的灰度值，并計算其相對含量。

1.4 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件；計量數據

2 結果

2.1 各AGA模型組小鼠毛發的變化 實驗組小鼠毛發生長速度較對照組緩慢，且實驗1組和實驗2組小鼠毛發表型與AGA患者類似。在脫毛后的第1個毛發生長周期（第0～40天）中，早期（第0～8天）實驗組小鼠和對照組間比較沒有差異，皮膚中沒有黑色素的積累；第10天實驗3組和對照組小鼠背部皮膚開始變黑，而實驗1組和實驗2組小鼠在第10天之后開始逐漸變黑；在第25天，對照組小鼠脫毛部位毛發已經完全長出，而實驗組小鼠部分皮膚直至第1個毛發生長周期結束也沒有長出毛發，見圖1。在脫毛后的第2個毛發生長周期（第40～65天）中，實驗1組和實驗2組部分小鼠在脫毛后的第1個毛發生長周期中未長出毛發的部位開始逐漸長出毛發，皮膚變黑，但毛發生長很快就結束，皮膚又開始變白；實驗組3組與對照組比較無明顯差異，見圖2。

2.2 各AGA模型組小鼠不同時期毛囊形態結構比較見圖3。

由圖3可見，第12、65天對照組小鼠皮膚中含有完整、成熟的毛囊結構，其球狀部位向下延伸至皮下，毛囊處于毛發生長初期Ⅵ期；而實驗組小鼠毛囊均處于真皮層中，毛囊球狀結構均呈萎縮狀態，處于毛發生長終期與毛發生長初期V期之間。而在第48、52天，對照組與實驗3組小鼠皮膚中都含有完整、成熟的毛囊結構，其球狀部位向下延伸至皮下，處于毛發生長初期Ⅵ期；而實驗1組和實驗2組小鼠皮膚中沒有完整的毛囊結構，毛囊球狀結構萎縮并位于真皮層中。

2.3 各AGA模型組小鼠不同時期皮膚中毛囊數目比較 見圖4。

由圖4可見，不同時期各組小鼠皮膚中毛囊數目比較均有統計學差異（均P＜0.05）；實驗 1、2、3組小鼠毛囊數目均少于對照組（均P＜0.05）。

圖1 各組小鼠第1個毛發生長周期的毛發表型

圖2 各組小鼠第2個毛發生長周期的毛發表型

圖3 各AGA組小鼠不同時期毛囊形態結構比較（HE染色，×10）

2.4 實驗1組與對照組小鼠毛囊中不同時期AGA突變基因的mRNA表達水平比較 見圖5。

由圖5可見，第12、25、52、65天實驗1組小鼠毛囊中AR的mRNA表達水平均高于對照組（均P＜0.05），而第40、48天兩組小鼠毛囊中AR的mRNA表達水平與對照組比較均無統計學差異（均PP＞0.05）。第12、48、52、65天實驗1組小鼠毛囊中5alpha2的mRNA表達水平均低于對照組（均P＜0.05），而第25、40天組小鼠毛囊中5alpha2的mRNA表達水平與對照組比較均無統計學差異（均 P ＞0.05）。第 12、25、40、48、52、65天實驗1組小鼠毛囊中5alpha1的mRNA表達水平比較均無統計學差異（均PP＞0.05）。

2.5 實驗1組與對照組小鼠毛囊中不同時期HF-SC活性標記物mRNA表達水平比較 見圖6。

由圖6可見，第12、65天實驗1組小鼠毛囊中K15的的mRNA表達水平均低于對照組（均P＜0.05），第25、40、48、52天實驗1組小鼠毛囊中K15的mRNA表達水平與對照組比較均無統計學差異（均PP＞0.05）。第12、48、52和65天實驗1組小鼠毛囊中Lgr5的mRNA表達水平均低于對照組（均P＜0.05），而第25、40天實驗1組小鼠毛囊中Lgr5的mRNA表達水平與對照組比較均無統計學差異（均 P ＞0.05）。第 12、25、40、48、52、65天實驗1組小鼠毛囊中CD34的mRNA表達水平與對照組比較均無統計學差異（均PP＞0.05）。

2.6 實驗1組與對照組AGA小鼠毛囊中不同時期毛發生長相關因子的mRNA表達水平比較 見圖7。

圖4 各AGA組小鼠不同時期皮膚中毛囊數目比較（與對照組比較，*P＜0.05；與實驗1組比較，△P＜0.05；與實驗2組比較，▲P＜0.05；與實驗3組比較，#P＜0.05）

圖5 實驗1組與對照組小鼠毛囊中不同時期AGA突變基因的mRNA表達水平比較（與對照組比較，*P＜0.05）

圖6 實驗1組與對照組小鼠毛囊中不同時期HF-SC活性標記物mRNA表達水平比較（與對照組比較，*P＜0.05）

由圖7可見，第12、48、52天實驗1組小鼠毛囊中FGFR、IGF-BP5、Ptch1及Wnt的mRNA表達水平均低于對照組（均P＜0.05）。第12、25天實驗1組小鼠毛囊中TGF-β的mRNA表達水平均低于對照組（均P＜0.05）。第40、48天實驗1組小鼠毛囊中PDGFRα的mRNA表達水平均低于對照組（均P＜0.05）。

2.7 實驗1組與對照組AGA小鼠毛囊中不同時期ECM相關蛋白的mRNA表達水平比較 見圖8。

由圖8可見，第12、48、52天實驗1組小鼠毛囊中LMα5的mRNA表達水平均低于對照組（均P＜0.05），而第12、52天LMα3的mRNA表達水平均高于對照組（均P＜0.05），但其他ECM相關蛋白LMα1、Collagen α6、Fibronectin、Nidogen1和 Nidogen2的 mRNA 表達水平與對照組比較均無統計學差異（均PP＞0.05）。

3 討論

非瘢痕性脫發是影響人們日常生活的最常見禿發類型，AGA作為非瘢痕性脫發的主要類型給患者帶來諸多負面影響，越來越多的患者渴望得到積極、有效的治療。由于缺少有效、相應的動物AGA模型，對AGA發生、發展的具體分子生物學機制的研究受到很大限制[4]。

本研究應用不同濃度的DHT處理小鼠，根據脫毛后小鼠毛發的生長周期，分別于生長期 Ⅵ-1（Ⅰ）、生長期 Ⅵ-2（Ⅰ）、休止期（Ⅰ）、生長期 Ⅰ（Ⅱ）、生長期Ⅵ-1（Ⅱ）、和生長期 Ⅵ-2（Ⅱ）和休止期（Ⅱ）[5-6]7個階段即脫毛后的第 8、12、25、40、48、52、65 天對小鼠進行取樣。Inui等[7]所闡述AGA的病理變化特征為毛發生長期縮短，毛囊變短、變細，色素減少，直至最初的大末端毛囊變成小毫毛毛囊且無色素沉著[8]。HE染色觀察發現不同濃度DHT處理后的小鼠在毛發生長不同階段無論是在毛發表型、毛囊結構，還是在毛囊數目上都與正常小鼠之間存在明顯變化。即DHT處理后小鼠毛囊分布不均且在大多數時期成萎縮狀態，尤其是實驗2組和實驗3組小鼠，小鼠毛囊數目呈周期性的漸進性降低，且均表現為休止期數目少于生長期Ⅵ期。這些現象與AGA患者表現相一致，表明在本研究中不同濃度的DHT均成功的誘導出AGA小鼠。

圖8 實驗1組與對照組AGA小鼠毛囊中不同時期ECM相關蛋白的mRNA表達水平比較（與對照組比較，*P＜0.05）

對AGA小鼠進行HF-SC活性標記物的mRNA表達水平分析，發現Lgr5的表達水平在休止期與生長期Ⅵ-1期之間呈下降趨勢，而CD34的表達水平無明顯變化。這表明DHT主要是通過抑制生長期Ⅰ與生長期Ⅵ-1期之間HF-SC的活化所產生的作用于毛發的生長周期。

進一步對已知AGA突變基因的檢測發現，當外源增加DHT含量，AR含量也相應增加，但在第40、48天小鼠AR含量并沒有增加，甚至呈下降趨勢。其原因可能是AR主要由真皮乳頭細胞合成，在第40、48天小鼠毛囊處于休止期-生長期Ⅰ期之間，真皮乳頭細胞數目減少，因而AR水平與對照組相比沒有增加。這不僅進一步說明經DHT處理的小鼠為AGA小鼠模型，而且提示，DHT在皮膚中發揮作用主要是通過與真皮乳頭細胞中的AR相結合。然而，在對實驗1組小鼠不同時期毛發生長相關因子進行分析時，發現PDGFRα的表達水平與對照組相比在第12、25、52天沒有明顯降低，而在第40、48天明顯降低。Gao等[9]研究通過對laminin-511突變型小鼠毛囊胚胎發育在第16.5天表現出障礙、毛囊結構消失的表型現象進行分子信號學分析，證明了由毛囊基底層上皮細胞分泌的laminin-511與其在間充質細胞膜上的受體integrin β亞基結合，促進初級絨毛的形成，進而激活Shh蛋白下游信號分子的活性；上皮細胞分泌的PDGF與間充質細胞膜上PDGF受體PDGFRα結合，在兩條通路的共同作用下，刺激間充質細胞分泌Noggin因子，去除對毛囊生成的抑制效應。由此表明，在皮膚細胞中可能還存在其他DHT信號通路，當AR含量高時，DHT與AR相互作用，抑制促毛發生長因子FGFR、IGF-BP5、Ptch1以及Wnt信號的表達，對毛囊的形成與發育產生抑制作用，毛囊生長遲緩；而當真皮乳頭細胞數目減少，AR含量降低時，DHT可能作用于另一信號通路，進而下調PDGFRα，維持對毛囊的抑制作用，使毛囊處于休止期。

本研究發現，當DHT水平一定，AR活性越高，細胞內5alpha2的水平降低。Inui等[7]研究顯示，無論是在男性還是女性AGA患者中，頭頂部毛囊中的5alpha活性較枕部毛囊中的明顯偏高。在正常機體，5alpha活性與DHT之間可能存在反饋調節作用，當外源增加DHT含量時，對5alpha的表達產生抑制，以在一定程度上維持皮膚中DHT的相對穩定；而AGA患者中這種反饋調節作用可能受到阻礙。

綜上所述，本研究通過不同濃度DHT處理成功誘導了AGA小鼠模型，為今后進一步研究AGA的發病機制以及AGA中不同毛發生長周期中細胞的分子變化提供了理想的動物模型。同時本研究證實了DHT能夠活化真皮乳頭細胞中的AR受體，與毛囊上皮細胞相互作用，對促毛發生長因子FGFR、IGF-BP5、Ptch1及Wnt信號的表達產生抑制，但其具體機制仍需進一步研究。

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Mechanism of androgenetic alopecia in mouse model

LIN Lei,YANG Mengjie,WU Xiao,et al.Ningbo College of Health

Sciences,Ningbo 315020，China

Objective To explore the mechanism of androgenetic alopecia(AGA)in mouse model.Methods AGA model was induced by subcutaneous injection of dehydrotestosterone (DHT)with concentration gradient method in 112 female mice.Hair depilation method was used to synchronize the initial stage of hair growth cycle of injected mice.The morphology and number of follicle were observed by H.E staining,and the mRNA expressions of signaling molecules in hair follicles were detected by RT-PCR. Results The follicular miniaturization and hair thinning were observed in mice treated with different concentration of DHT throughout the hair cycle.RT-PCR results showed the expression of androgen receptor(AR)was increased in whole hair cycle,but decreased at d40 and d48.The mRNA expression of stem cell marker Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5(Lgr5)was decreased during telogen and anagen VI phases,while the expression of CD34 had no significant changes.The expressions of FGFR,IGF-BP5,Ptch1 and Wnt were reduced compared with control group.Coinciding with decreased AR expression at d40 and d48,the levels of PDGFRα were significantly declined (P＜0.05).The expression of basement membrane components laminin α3 was up-regulated,and laminin α5 was down-regulated in DHT-induced AGA mouse. Conclusion DHT can stably induce androgenetic alopecia in mice.DHT can inhibit the expression of hair growth factor FGFR,IGF-BP5,Ptch1 and Wnt signaling by activating the AR in DP cells and interacting with epithelial cells in the hair follicle.

Dehydrotestosterone Androgen receptorAlopecia Modelm Signal pathway雄激素性脫毛（androgenetic alopecia，AGA）作為非 瘢痕性禿發疾病中最常見的一類，影響著70%男性和40%女性的生活，在美國其發病率在50%～80%[1]。二氫睪酮（dehydrotestosterone，DHT）可經毛發乳頭細胞周圍的毛細血管滲出或直接由毛發乳頭細胞生成，并與毛發乳頭細胞膜上的雄激素受體（AR）相結合，導致毛發生長異常[2-3]。本研究將不同濃度的DHT作用于雌性小鼠，建立AGA小鼠模型，并利用該模型探討DHT導致AGA發生、發展的分子機制，現報道如下。

2017-01-16）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2017-128

國家自然科學基金（81101206）；寧波市自然科學基金（2013A610253）

315200 寧波衛生職業技術學院（林蕾）；寧波大學醫學院（楊夢潔、高晶）；寧波大學醫學院附屬醫院腫瘤血液科（吳驍、王少敏、倪曙民、葉孟）

林蕾，E-mail：1596250063@qq.com

圖7 實驗1組與對照組AGA小鼠毛囊中不同時期毛發生長相關因子的mRNA表達水平比較（與對照組比較，*P＜0.05）