粉防己堿對酮康唑抗近平滑念珠菌復合體的體外增效活性研究

趙亞婧 李水秀 蔣玲 宋延君 郭慧 劉維達 沈永年 朱坤舉 張宏

510632廣州，暨南大學附屬第一醫(yī)院真菌病研究所（趙亞婧、李水秀、蔣玲、宋延君、郭慧、朱坤舉、張宏）；中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所真菌科（劉維達、沈永年）

粉防己堿對酮康唑抗近平滑念珠菌復合體的體外增效活性研究

趙亞婧 李水秀 蔣玲 宋延君 郭慧 劉維達 沈永年 朱坤舉 張宏

510632廣州，暨南大學附屬第一醫(yī)院真菌病研究所（趙亞婧、李水秀、蔣玲、宋延君、郭慧、朱坤舉、張宏）；中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所真菌科（劉維達、沈永年）

目的探討粉防己堿在體外對酮康唑抗近平滑念珠菌復合體有無增效作用。方法參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）推薦的M27?A3方案，采用棋盤式微量稀釋法測定酮康唑單獨及聯(lián)合粉防己堿抗21株近平滑念珠菌復合體臨床株抗真菌活性，結(jié)合部分抑制濃度指數(shù)（FICI）對結(jié)果進行評價；以甲基四氮鹽（XTT）法分別測定不同時間點藥物作用的效果，繪制時間殺菌曲線，動態(tài)觀察藥物體外抗近平滑念珠菌復合體活性。結(jié)果粉防己堿與酮康唑單獨作用于21株近平滑念珠菌復合體菌株的最低抑菌濃度分別是32～64 mg/L和0.031 25～2 mg/L，兩藥聯(lián)合時最低抑菌濃度分別降至2～8 mg/L和0.008～0.25 mg/L，F(xiàn)ICI值為0.09～0.5；時間殺菌曲線表明，與酮康唑單用組和粉防己堿單用組相比，酮康唑聯(lián)合粉防己堿組真菌生長延遲明顯。結(jié)論粉防己堿在體外對酮康唑抗近平滑念珠菌復合體有明顯的增效作用。

念珠菌屬；酮康唑；粉防己堿；藥物協(xié)同作用；近平滑念珠菌復合體

念珠菌感染的全球流行病學狀況正在發(fā)生變 化［1］。近年來，近平滑念珠菌復合體（Candidaparapsilosiscomplex，簡稱近平滑念珠菌）等非白念珠菌的發(fā)病率和病死率逐年升高［2?4］。在拉美、歐洲和亞太等部分地區(qū)，近平滑念珠菌已經(jīng)成為第二常見的侵襲性致病念珠菌［5］。唑類藥物，如酮康唑（ketoconazole，KCZ），對念珠菌有較強的抗菌活性，是臨床上治療念珠菌感染的常用抗真菌藥物，但伴隨其廣泛、長期使用，耐藥菌株有明顯增多趨勢［6］，已經(jīng)成為困擾臨床的重要難題。

粉防己堿（tetrandrine，TET）是天然藥用植物中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，臨床上具有抗炎、抗腫瘤、降低門脈高壓等作用，近年來我們課題組已證明其對氟康唑等唑類抗真菌藥物在體內(nèi)外抗白念珠菌、煙曲霉等均有顯著增效活性，作用機制與抑制藥物外排泵基因有關［7?8］。本實驗中我們以21株近平滑念珠菌臨床株作為非白念珠菌代表，體外研究TET對KCZ的增效活性，為臨床上以TET作為唑類藥物增效劑治療念珠菌病提供實驗室依據(jù)。

材料和方法

一、菌株和主要試劑

21株近平滑念珠菌臨床分離株（JS425、JS426、JS427、JS428、JS429、JS430、JS431、JS432、JS433、JS434、JS436、JS437、JS439、JS440、JS441、JS442、JS443、JS444、JS445、JS446、ATCC22019）均來自于中國微生物菌種保藏管理委員會醫(yī)學真菌中心。質(zhì)控菌株選用美國臨床和試驗標準協(xié)會（CLSI）推薦的近平滑念珠菌ATCC 22019。KCZ（純度＞98.5%，由西安楊森制藥有限公司提供，批號P006766）；TET（批號 T2695，純度＞98%，美國Sigma公司）。

二、方法

1.菌懸液和藥液制備：將受試菌株于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）中35℃轉(zhuǎn)種2次，挑取單個較大菌落用生理氯化鈉溶液配制菌懸液，以中國細菌標準濁度管比濁，調(diào)整至工作濃度為（0.5～2.5）×103cfu/ml，菌液新鮮制備［9］。KCZ 用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成4 g/L的儲備液；TET用滅菌雙蒸水和0.1 mg/L HCl溶解，配制成濃度為3 g/L的儲備液。

2.測定TET、KCZ單獨對近平滑念珠菌的最低抑菌濃度（MIC）：根據(jù)CLSI?M27 A3酵母菌液基微量稀釋法［10］進行測定。用RPMI 1640液體培養(yǎng)基將藥物儲備液稀釋至2倍工作濃度。取100 μl倍比稀釋后依次加入96孔板的第2～11列；第1列為生長對照；第12列為空白對照。除第12列外，其余各孔再分別加入100 μl菌懸液至工作濃度（0.5～2.5）×103cfu/ml。將制備好的96孔板置35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用酶標儀測定吸光度A490值，確定MIC值。計算公式如下：真菌生長百分率=（各孔A值-空白對照孔A值）/（生長對照孔A值-空白對照孔A值）× 100%［11?12］。真菌生長抑制百分數(shù) =（1- 真菌生長百分數(shù)）×100%。取真菌生長抑制百分數(shù)在80%以上的最低藥物濃度為MIC值。實驗重復進行3次。

3.TET與KCZ聯(lián)合抗近平滑念珠菌活性測定：參照 CLSI M27?A3［10］方案，以棋盤法測定 TET 與KCZ聯(lián)合對21株近平滑念珠菌的體外抗真菌活性。通過上述實驗確定TET與KCZ的適當濃度范圍，以RPMI 1640液體培養(yǎng)基分別將兩種藥物儲備液稀釋至4倍工作濃度（終濃度范圍分別是：TET 4～256 mg/L，KCZ 0.008～8 mg/L）。按照濃度從低到高的順序，取倍比稀釋的KCZ和TET藥液各50 μl分別加入96孔板的第2～12列和第A～G行。除A12孔之外，其余各孔再分別加入菌懸液100 μl。不足200 μl液體的孔用RPMI 1640液體培養(yǎng)基補足。將制備好的96孔板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，根據(jù)吸光度A490值判讀結(jié)果。實驗重復進行3次。采用部分抑制濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）評價兩藥相互作用。計算公式如下：FICI=MICAB/MICA+MICBA/MICB，式中的MICA和MICB分別表示藥物A和B單用時的MIC值，MICAB和MICBA分別表示兩種藥物聯(lián)用時各自的MIC值。當FICI≤0.5時，兩藥相互作用為協(xié)同作用，F(xiàn)ICI≤4且＞0.5時為無關作用，＞4時為拮抗作用［13］。以KCZ MIC ≤ 0.125 mg/L為敏感（S），0.25～0.5 mg/L為劑量依賴性敏感（SDD），≥1 mg/L為耐藥（R）［14］。

4.時間-殺菌曲線測定：以耐藥株JS431和敏感株JS440為測試菌株，參照前期研究方法［13］，以RPMI 1640液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×105cfu/ml工作濃度。以各試驗菌株MIC值的試驗結(jié)果為依據(jù)，配制含TET和KCZ的RPMI 1640液體培養(yǎng)基。分別在50 ml無菌離心管中制備生長對照組（不加藥）、TET單用組、KCZ單用組和TET與KCZ聯(lián)合用藥組，每個體系總體積為5 ml。將各作用體系于37 ℃靜置培養(yǎng)，并于藥物作用開始后0、6、12、24、48 h分別從各作用體系中連續(xù)3次吸取菌液100 μl加入到96孔平板內(nèi)，每孔中再加入配好的甲基四氮鹽（XTT）-甲萘醌溶液100 μl，37 ℃避光培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定A490值。實驗重復3次，取平均值。以培養(yǎng)時間（h）為橫坐標，每一時間測定點A490的均數(shù)為縱坐標，繪制時間-殺菌曲線。

結(jié) 果

一、KCZ單獨及聯(lián)合TET抗近平滑念珠菌活性

TET與KCZ單獨或聯(lián)合作用于21株近平滑念珠菌的MIC值見表1。

實驗所用的21株近平滑念珠菌中，JS431、JS439為KCZ耐藥株，JS432、JS442、JS443為劑量依賴性敏感株，其余均為KCZ敏感株。單獨用藥時，KCZ和TET的MIC值范圍為0.031 25～2 mg/L和32～64 mg/L，聯(lián)合用藥后分別降至0.008～0.25 mg/L和2～8 mg/L，F(xiàn)ICI值為0.09～0.5，均表現(xiàn)為協(xié)同作用（表1）。兩藥聯(lián)合時，其MIC終點清晰，“拖尾現(xiàn)象”消失。

二、時間殺菌曲線

見圖1，2。結(jié)果顯示TET單獨使用時對生長曲線幾乎無影響，抗真菌作用極弱。在藥物作用6 h前，各組之間的生長曲線幾乎重合。而6 h后，含有KCZ的各組生長曲線出現(xiàn)生長延遲，KCZ與TET聯(lián) 用組更明顯。在24 h和48 h時，耐藥株（JS431）與敏感株（JS440）中KCZ和TET聯(lián)用組比KCZ單獨作用組的A值均下降至少2倍。

表1 粉防己堿（TET）與酮康唑（KCZ）單獨或聯(lián)合對21株近平滑念珠菌的體外抗菌活性

圖1 酮康唑與粉防己堿聯(lián)用抗耐藥近平滑念珠菌株JS431的時間-殺菌曲線圖

圖2 酮康唑與粉防己堿聯(lián)用抗敏感近平滑念珠菌株JS440的時間-殺菌曲線圖

討 論

唑類藥物作為目前治療和預防念珠菌感染最廣泛使用的抗真菌藥物，其耐藥菌株的大量檢出對抗真菌藥物的研究提出了新的挑戰(zhàn)。據(jù)全球性研究ARTEMIS念珠菌監(jiān)測項目顯示，近平滑念珠菌的分離率和對唑類藥物的耐藥率分別由2000年前的4.8%、2.5%升至2000年后的6.9%和3.5%。中國首個真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)CHIF?NET 2010項目中，分離出的近平滑念珠菌株數(shù)占總分離念珠菌總數(shù)的17.7%，對唑類藥物的耐藥率為1.4%［6，15］。因此，減緩菌株耐藥性的產(chǎn)生已成為抗真菌藥物研究的新主題。我國植物資源物種豐富，大量學者從傳統(tǒng)中藥中發(fā)現(xiàn)能夠增強唑類藥物抗念珠菌活性的成分，且體外協(xié)同抗真菌作用的機制研究多數(shù)是針對白念珠菌的。然而目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)市面上存在一種安全、有效且作用機制明確的抗真菌藥物增效劑，尤其針對非白念珠菌的相關研究更為缺乏。

我們使用棋盤式微量液基稀釋法檢測TET與KCZ聯(lián)用抗近平滑念珠菌的MIC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TET在體外單獨用藥時抗真菌活性極弱，但當與KCZ聯(lián)用時，KCZ的MIC值降低3～7個梯度，TET自身的MIC也降低3～5個梯度，F(xiàn)ICI值介于0.09～0.5之間，表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用。時間-殺菌曲線法以耐藥株JS431和敏感株JS440為研究對象，我們發(fā)現(xiàn)TET單獨使用時對生長曲線幾乎無影響，當其與KCZ聯(lián)合時能顯著增強KCZ的抗真菌活性，與棋盤法所得結(jié)果具有良好的一致性。結(jié)合本研究及本課題組前期研究，TET是一種具有應用前景的抗真菌藥物增效劑，這不僅為臨床以TET作為KCZ增效劑治療近平滑念珠菌病提供了科學依據(jù)，也為我們進一步研究TET對唑類藥物的增效活性及機制打下基礎。

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《中國皮膚性病學書目提要及著者傳略》征文及研修班招生

為了系統(tǒng)總結(jié)我國皮膚性病學文獻及介紹做出重要貢獻的著者，廖萬清院士、禤國維國醫(yī)大師領銜編輯《中國皮膚性病學書目提要及著者傳略》。凡為該書提供書目及著者傳略者、向籌建的中國皮膚科博物館贈送文物者，可獲贈《中國皮膚科學史》（600元）1冊。

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陜西馬振友藥業(yè)有限公司，手機/微信：13227015533，13379033002；QQ：386966727。

In vitro synergistic effect of tetrandrine on ketoconazole against Candida parapsilosis complex

Zhao Yajing,Li Shuixiu,Jiang Ling,Song Yanjun,Guo Hui,Liu Weida,Shen Yongnian,Zhu Kunju,Zhang Hong
Institute of Mycology,The First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510632,China（Zhao YJ,Li SX,Jiang L,Song YJ,Guo H,Zhu KJ,Zhang H）;Department of Mycology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Liu WD,Shen YN）

s:Zhu Kunju,Email:zhukunju1111@163.com;Zhang Hong,Email:tzhangh@jnu.edu.cn

ObjectiveTo evaluate thein vitrosynergistic effect of tetrandrine on ketoconazole againstCandida parapsilosiscomplex.MethodsAccording to the Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）M27?A3 guidelines,the microdilution checkerboard method was used to evaluatein vitroantifungal activities of ketoconazole alone and in combination with tetrandrine against 21 clinical isolates ofCandida parapsilosiscomplex based on the fractional inhibitory concentration index（FICI）.Antifungal effects of the above drugs at different time points were evaluated by the XTT assay,and then time?killing curves were drawn and assessed to investigate thein vitrodynamic antifungal activity.ResultsThe minimum inhibitory concentrations（MICs）of tetrandrine and ketoconazole alone against 21 clinical isolates ofCandida parapsilosiscomplex were 32-64 mg/L and 0.031 25-2 mg/L,respectively.When ketoconazole was combined with tetrandrine,MICs of tetrandrine and ketoconazole were reduced to 2-8 mg/L and 0.008-0.25 mg/L respectively,and the FICI ranged from 0.09 to 0.5.The time?killing curves revealed that the fungal growth was delayed obviously in the combination group compared with the ketoconazole alone group and tetrandrine alone group.ConclusionTetrandrine has obvious synergistic effects on ketoconazole againstCandida parapsilosiscomplexin vitro.

Candida;Ketoconazole;Tetrandrine;Drug synergism;Candida parapsilosiscomplex

朱坤舉，Email：zhukunju1111@163.com；張宏，Email：tzhangh@jnu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.007

國家自然科學基金（81171542、81471995）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81171542,81471995）

2016?10?11）

（本文編輯：尚淑賢）