葫蘆素I對HaCaT細胞體外增殖及對角蛋白17、STAT3、VEGF表達的影響

姚秋楠 魏志平 劉彥群

221002江蘇，徐州醫科大學附屬醫院皮膚科（第三作者現在江蘇省醫學會）

葫蘆素I對HaCaT細胞體外增殖及對角蛋白17、STAT3、VEGF表達的影響

姚秋楠 魏志平 劉彥群

221002江蘇，徐州醫科大學附屬醫院皮膚科（第三作者現在江蘇省醫學會）

目的探討葫蘆素I對HaCaT細胞體外增殖及角蛋白17（K17）、信號轉導及轉錄激活子3（STAT3）、血管內皮生長因子（VEGF）表達的影響。方法采用不同濃度葫蘆素I（0.0125、0.025、0.05、0.1 μmol/L）、含與0.1 μmol/L葫蘆素I等體積DMSO的DMEM培養液（溶媒組）、DMEM培養液（陰性對照組）、10 nmol/L卡泊三醇（陽性對照組）分別作用于HaCaT細胞。采用CCK8法檢測葫蘆素I作用12、24、36 h后對HaCaT細胞體外增殖的影響，RT?PCR法檢測葫蘆素I作用24 h對HaCaT細胞K17和VEGF mRNA表達的影響，Western印跡法檢測葫蘆素I作用24 h對HaCaT細胞K17、STAT3、磷酸化STAT3（P?STAT3）和VEGF蛋白表達的影響。結果0.0125 μmol/L葫蘆素I作用12 h即開始表現出對HaCaT細胞體外增殖的抑制作用，當葫蘆素I濃度增加到0.1 μmol/L時，24 h和36 h的抑制率分別為43.00%±2.11%和48.98%±2.27%。與陰性對照組相比，各濃度葫蘆素I組對HaCaT細胞體外增殖均有抑制作用（均P＜0.05），且該抑制作用隨葫蘆素I濃度的增加及作用時間的延長逐漸增強。不同濃度葫蘆素I作用于HaCaT細胞24 h后，K17 mRNA及其蛋白、P?STAT3蛋白、VEGF mRNA及其蛋白表達量均隨葫蘆素I濃度的增加而降低，差異有統計學意義（均P＜0.05）。結論葫蘆素I可抑制HaCaT細胞的體外增殖，并可在mRNA水平下調K17、VEGF的表達，在蛋白水平下調K17、P?STAT3、VEGF的表達。

葫蘆素類；角蛋白17；STAT3轉錄因子；血管內皮生長因子類；HaCaT細胞

葫蘆素I是從葫蘆科植物中提取出來的一種四環三萜類復合物，可抑制多種腫瘤細胞增殖、粘附、遷移及血管生成，并可抑制信號轉導及轉錄激活子3（STAT3）磷酸化［1］。角蛋白17（K17）是一個含432個氨基酸的結構蛋白，由中間的α螺旋桿狀域和兩側的非螺旋頭域及尾域三部分構成［2］。研究發現，銀屑病皮損中活化的角質形成細胞過表達K17，而正常皮膚與非銀屑病皮損中K17表達無明顯增高，因此認為K17是銀屑病的標志之一［3］。許多研究已表明角質形成細胞中K17可依賴STAT3活化途徑表達上調。本實驗研究了葫蘆素I對HaCaT細胞體外增殖及對K17、STAT3、血管內皮生長因子（VEGF）表達的影響，旨在探討葫蘆素I能否成為治療銀屑病的潛在藥物及其可能的作用機制。

材料與方法

一、細胞與試劑

人永生化角質形成細胞株HaCaT細胞（上海復祥生物科技有限公司），葫蘆素I（批號14747，純度 ≥98%，美國Cyagen公司），卡泊三醇（批號VICI1532，純度＞98%，徐州微科曼得生物工程有限公司），DMEM培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），Cell Counting Kit?8（CCK?8）試劑盒（上海碧云天生物技術研究所），鼠抗人STAT3單克隆抗體、兔抗人磷酸化STAT3（P?STAT3）單克隆抗體（Tyr705）（美國Cell Sighaling公司），兔抗人K17單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體（美國Abcam公司），兔抗人VEGF多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），反轉錄及PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司產品）。RT?PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計。

二、細胞培養及實驗分組

HaCaT細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養液中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養。待細胞長滿瓶底后，以含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，接種于培養瓶內，置培養箱中培養24 h貼壁后，更換無血清、無雙抗DMEM培養液，并加入不同濃度葫蘆素I。根據Kim等［4］選用的葫蘆素I濃度梯度及我們的預實驗結果，最終將實驗分為0.0125、0.025、0.05、0.1 μmol/L葫蘆素I組、溶媒組（含與0.1 μmol/L葫蘆素I等體積DMSO的DMEM培養液）、陰性對照組（DMEM培養液）和陽性對照組（10 nmol/L卡泊三醇）［5］。

三、CCK8法檢測葫蘆素I對HaCaT細胞體外增殖的抑制作用

取HaCaT細胞9×103/ml接種于96孔培養板，每孔100 μl，培養24 h。細胞貼壁后，實驗分組同上，每組設6個復孔，分別培養12、24、36h后終止培養。棄去原培養基，將無血清、無雙抗DMEM培養液與CCK?8試劑按10∶1比例混勻，每孔加入100 μl混勻液，于培養箱中孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長處每孔的吸光度（A）值，實驗重復3次取均值，計算細胞增殖抑制率=（1－給藥組A值/陰性對照組A值）×100%。

四、Western印跡法測定HaCaT細胞K17、STAT3、P?STAT3及VEGF的表達

取對數生長期的HaCaT細胞以1×105/ml置于100 ml培養瓶中，每瓶10 ml，待細胞貼壁生長后，棄去原培養基，按上述實驗分組進行實驗。培養24 h后收集各組細胞，提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，上樣80 μg進行電泳、轉膜及封閉，一抗（鼠抗人STAT3單克隆抗體滴度為1∶1 000，兔抗人P?STAT3單克隆抗體為1∶2 000，兔抗人K17單克隆抗體為1∶4 000，兔抗人VEGF多克隆抗體為1∶300，兔抗人GAPDH單克隆抗體為1∶9 000）孵育4℃過夜，二抗（辣根酶標記山羊抗小鼠IgG抗體滴度及辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體均為1∶500）孵育2 h，ECL發光液顯色，暗室曝光觀察結果。目的蛋白條帶STAT3、P?STAT3、K17、VEGF與相應的內參照GAPDH條帶的灰度值比值作為其蛋白表達的半定量指標。

五、RT?PCR法測定HaCaT細胞K17及VEGF的表達

選用對數生長期HaCaT細胞，以1×105/ml接種于6孔板，每孔2 ml，培養24 h后，棄去原培養基，按上述實驗分組進行實驗。各組細胞培養24 h后提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA。目的基因K17正向引物5′?CCTGGCGGAGACAGAGAAC?3′，反向引物 5′?GATGACCTTGCCATCCTGGAC?3′，擴增片段為283 bp；VEGF正向引物5′?GGCAAAGTGAGTG ACCTGCT?3′，反向引物5′?AGAACAGCCCAGAAGT TGGA?3′，擴增片段為273 bp；內參照β肌動蛋白正向引物5′?TGACGTGGACATCCGCAAAG?3′，反向引物5′?CTGGAAGGTGGACAGCGAGG ?3′，擴增片段為205 bp。PCR反應體系為25 μl，擴增條件為：K17和VEGF：94℃預變性3 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，共35個循環，最后72℃延伸5 min；β肌動蛋白：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環，最后72℃延伸5 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統掃描拍照，檢測各電泳條帶的灰度值，計算與β肌動蛋白比值，得到目的產物的相對含量。

圖1 不同濃度葫蘆素I作用HaCaT細胞12、24、36 h后對其體外增殖的抑制作用

表1 不同濃度葫蘆素I作用HaCaT細胞12、24、36 h后對其體外增殖的抑制作用（±s）

表1 不同濃度葫蘆素I作用HaCaT細胞12、24、36 h后對其體外增殖的抑制作用（±s）

注：n=3。A值：吸光度值；a：與陰性對照組相比，P ＜ 0.05；b：與卡泊三醇組相比，P ＜ 0.05

組別陰性對照組溶媒組0.0125 μmol/L葫蘆素I組0.025 μmol/L葫蘆素I組0.05 μmol/L葫蘆素I組0.1 μmol/L葫蘆素I組卡泊三醇組12 h A值0.924±0.037 0.914±0.037 0.860±0.031ab 0.779±0.024ab 0.700±0.020ab 0.622±0.015a 0.640±0.013a抑制率（%）0 1.04±0.33 6.94±1.14ab 15.70±2.12ab 24.17±2.10ab 32.68±1.79a 30.73±1.94a 24 h A值0.780±0.039 0.768±0.039 0.670±0.035ab 0.576±0.036ab 0.522±0.041ab 0.444±0.019a 0.462±0.015a抑制率（%）0 1.58±0.55 14.08±1.33ab 26.17±2.37ab 33.14±2.80ab 43.00±2.11a 40.63±2.22a 36 h A值0.578±0.046 0.567±0.047 0.472±0.035ab 0.396±0.031ab 0.350±0.032ab 0.295±0.024a 0.306±0.028a抑制率（%）0 1.86±0.77 18.22±1.66ab 31.35±1.70ab 39.46±2.61ab 48.98±2.27a 47.02±2.96a

六、統計學分析

采用SPSS16.0統計軟件進行分析，計量資料用±s表示。各組HaCaT細胞增殖抑制率隨時間的變化采用重復測量的方差分析，RT?PCR法和Western印跡法測定結果采用單因素方差分析，相關分析用Spearman相關分析，并用相關系數rs表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、葫蘆素I對HaCaT細胞體外增殖的影響

重復測量的方差分析顯示，時間因素主效應有統計學意義（F=2628.8，P＜ 0.05），說明HaCaT細胞體外增殖的抑制率有隨時間變化的趨勢；藥物濃度與時間之間存在交互效應（F=2.93，P＜0.05），說明各組HaCaT細胞的增殖抑制率隨時間變化的趨勢不同；分組因素也起作用（F=534.195，P＜0.05），說明不同分組間HaCaT細胞的增殖抑制率總體而言不同。0.0125 μmol/L葫蘆素I作用12 h即開始表現出對HaCaT細胞體外增殖的抑制作用（圖1）。與陰性對照組相比，各濃度葫蘆素I組對HaCaT細胞體外增殖有抑制作用（均P＜0.05，表1），且各濃度葫蘆素I組間比較差異有統計學意義（均P＜0.05），葫蘆素I濃度越高，抑制作用越強。隨作用時間延長，各葫蘆素I對HaCaT細胞增殖的抑制作用亦逐漸增強，12～24 h與24～36 h兩個時間段相比，前者抑制率上升更快（圖1），故選擇24 h為后續實驗的時間點。各時間點溶媒組HaCaT細胞體外增殖的抑制率與陰性對照組相比，差異無統計學意義（均P＞0.05），故可排除溶媒DMSO對本實驗結果的影響。各時間點卡泊三醇組HaCaT細胞體外增殖抑制率與0.1 μmol/L葫蘆素I組差異無統計學意義（P＞0.05），但顯著高于其他3個葫蘆素I組（P＜ 0.05）。

二、葫蘆素I對HaCaT細胞K17 mRNA及其蛋白表達的影響

不同濃度葫蘆素I作用HaCaT細胞24 h后，K17 mRNA及蛋白的表達量隨葫蘆素I濃度的增加不斷降低（表2，圖2），各組K17 mRNA及蛋白相對表達量差異均有統計學意義（F=45.972、41.219，均P＜0.05）。與陰性對照組相比，各濃度葫蘆素I及卡泊三醇均能顯著降低HaCaT細胞K17 mRNA及蛋白的表達（均P＜0.05），而溶媒組與陰性對照組相比差異無統計學意義（P＞ 0.05）。0.0125、0.025、0.05 μmol/L葫蘆素I對HaCaT細胞K17 mRNA及蛋白表達的抑制作用顯著弱于卡泊三醇（均P＜0.05），而0.1 μmol/L葫蘆素I組與卡泊三醇陽性對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。相關分析顯示，葫蘆素I下調K17 mRNA及其蛋白表達的作用隨著葫蘆素I濃度增加而逐漸增強（rs=-0.950、-0.972，均P＜ 0.05）。

三、葫蘆素I對HaCaT細胞STAT3及P?STAT3蛋白表達的影響

不同濃度葫蘆素I作用HaCaT細胞24 h后，各組STAT3蛋白表達情況基本一致，而各組P?STAT3蛋白的表達則明顯下調（圖3）。與陰性對照組相比，各濃度葫蘆素I組及卡泊三醇組HaCaT細胞P?STAT3/STAT3均顯著降低（P＜0.05），而溶媒組與陰性對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。0.0125、0.025、0.05 μmol/L葫蘆素I對HaCaT細胞P?STAT3蛋白的抑制作用明顯低于卡泊三醇，差異有統計學意義（P＜0.05），而0.1 μmol/L葫蘆素I組與卡泊三醇陽性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。相關分析顯示，隨葫蘆素I濃度的增加，P?STAT3蛋白的表達逐漸降低（r=-0.951，P＜0.05）。

表2 不同濃度葫蘆素I作用HaCaT細胞24 h后對角蛋白17、血管內皮生長因子mRNA和蛋白以及STAT3、P?STAT3蛋白表達的影響（±s）

表2 不同濃度葫蘆素I作用HaCaT細胞24 h后對角蛋白17、血管內皮生長因子mRNA和蛋白以及STAT3、P?STAT3蛋白表達的影響（±s）

注：n=3。a：與陰性對照組相比，P ＜ 0.05；b：與卡泊三醇組相比，P ＜ 0.05

組別P?STAT3/STAT3陰性對照組溶媒組0.0125 μmol/L葫蘆素I組0.025 μmol/L葫蘆素I組0.05 μmol/L葫蘆素I組0.1 μmol/L葫蘆素I組卡泊三醇組F值P值角蛋白17 mRNA 1.039±0.022 1.030±0.051 0.856±0.095ab 0.712±0.073ab 0.560±0.050ab 0.362±0.088a 0.411±0.088a 45.972＜0.05蛋白1.023±0.089 1.020±0.081 0.830±0.059ab 0.666±0.040ab 0.517±0.051ab 0.362±0.074a 0.369±0.114a 41.219＜0.05血管內皮生長因子mRNA 0.899±0.077 0.873±0.087 0.717±0.064ab 0.562±0.070ab 0.436±0.034a 0.299±0.058a 0.343±0.081a 37.463＜0.05蛋白0.926±0.071 0.945±0.058 0.757±0.073ab 0.573±0.015ab 0.408±0.081a 0.221±0.103a 0.278±0.159a 32.974＜0.05 0.860±0.028 0.889±0.026 0.726±0.048ab 0.585±0.068ab 0.398±0.125ab 0.269±0.063a 0.240±0.077a 45.467＜0.05

圖2 不同濃度葫蘆素I作用HaCaT細胞24 h后K17蛋白的表達 1：陰性對照組；2：溶媒組；3 ～ 6：分別為0.0125、0.025、0.05、0.1 μmol/L葫蘆素I組；7：10 nmol/L卡泊三醇組

圖3 不同濃度葫蘆素I作用HaCaT細胞24 h后P?STAT3、STAT3蛋白的表達 1：陰性對照組；2：溶媒組；3～6：分別為0.0125、0.025、0.05、0.1 μmol/L葫蘆素I組；7：10 nmol/L卡泊三醇組

四、葫蘆素I對HaCaT細胞VEGF mRNA及蛋白表達的影響

不同濃度葫蘆素I作用HaCaT細胞24 h后，各組VEGF mRNA及蛋白的相對表達量差異均有統計學意義（F=37.463、32.974，均P＜ 0.05），見表2。與陰性對照組相比，各濃度葫蘆素I及卡泊三醇均能顯著降低HaCaT細胞VEGF mRNA及蛋白的表達（均P＜0.05），而溶媒組與陰性對照組相比差異無統計學意義（P＞ 0.05）。0.0125、0.025 μmol/L葫蘆素I對HaCaT細胞VEGF mRNA及蛋白表達的抑制作用顯著低于卡泊三醇（均P＜ 0.05），而0.05、0.1 μmol/L葫蘆素I組與卡泊三醇陽性對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。相關分析顯示，隨葫蘆素I濃度的增加，VEGF mRNA及其蛋白表達逐漸下降（rs=-0.972、-0.970，均P＜ 0.05）。

討 論

在傳統醫學中，葫蘆素用于解熱、止痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤活性，葫蘆素I可有效抑制多種人類癌細胞生長，包括惡性膠質瘤細胞、肝癌細胞、鼻咽癌細胞和前列腺癌細胞等［6］。已經證實葫蘆素I可有效抑制血管生成，并能顯著抑制STAT3信號活化［1］，而該信號的活化在銀屑病的發生發展中有著重要的作用。研究表明［7］，角質形成細胞中活化的STAT3信號直接影響銀屑病皮損的病理發展，STAT3是一種潛在的胞質蛋白，當受到白細胞介素6（IL?6）、IL?11、表皮生長因子（EGF）等其他細胞因子及生長因子刺激后，被羧基末端Tyr705殘基磷酸化而激活，磷酸化反應之后，STAT3轉移至核內連接特異性STAT3靶基因啟動子反應元件，調節轉錄。

K17是一種存在于復層上皮如指甲、頭皮毛囊、皮脂腺及小汗腺的中間絲蛋白，研究發現，K17在銀屑病皮損中高表達，而在正常皮膚與非銀屑病皮損中的表達無明顯增高［5］。Zhang等［8］研究表明，角質形成細胞中IL?22可通過激活STAT3以劑量依賴方式上調K17的表達，這種上調可以被STAT3特異性抑制劑白皮杉醇以及小干擾RNA（siRNA）部分抑制，該研究也證實了角質形成細胞中K17依賴STAT3機制上調表達，加速銀屑病的發展。K17分子中至少有5個銀屑病相關T細胞表位，有些表位與ALEEAN序列類似，故K17可作為一種自身抗原，其表位可以激活T細胞（如Th1細胞、Th17細胞以及產生IL?22的T細胞）的增殖，活化的T細胞產生銀屑病相關細胞因子干擾素γ（IFN?γ）、IL?17、IL?22等，這些細胞因子又可以依賴上述信號通路激活角質形成細胞表達K17，繼而形成了一個反饋環路再次激活T細胞增殖和銀屑病相關細胞因子的產生，這個反饋環路即K17/T細胞/細胞因子自身免疫環路［9］，參與銀屑病的發生發展。

本研究采用CCK8法檢測到不同濃度葫蘆素I對HaCaT細胞體外增殖均有抑制作用，12～24 h時間段較24～36 h時間段抑制率上升的更快，0.1 μmol/L葫蘆素I作用36h抑制率達48.98%±2.27%。RT?PCR法和Western印跡法表明，葫蘆素I可下調K17 mRNA和蛋白以及P?STAT3蛋白的表達，且隨葫蘆素I濃度增加，下調作用增強。相關性分析表明，P?STAT3與K17蛋白表達量之間成正相關（r=0.959，P＜ 0.05），推測葫蘆素I可能抑制STAT3信號通路的磷酸化，阻斷STAT3向核內轉移，從而阻止磷酸化STAT3與K17啟動子結合，使得K17表達量下降，進而阻斷K17/T細胞/細胞因子這個自身免疫環路。

VEGF在銀屑病發病機制中是一個重要的血管生成調節劑，在銀屑病患者皮損斑塊及血漿中均呈高水平，血清VEGF水平與銀屑病病情嚴重程度具有相關性［10］。研究證明［11］，活化的STAT3可以上調VEGF的表達并促進血管生成，Qi等［1］研究表明葫蘆素I可通過降低STAT3活化抑制乳腺癌的血管生成。本研究RT?PCR法和Western印跡法檢測結果顯示，不同濃度葫蘆素I可下調VEGF mRNA及蛋白的表達，同時也發現P?STAT3與VEGF蛋白表達量之間成正相關（r=0.928，P＜ 0.05），進一步證明STAT3可以上調VEGF的表達。

綜上所述，本研究發現，葫蘆素I可抑制HaCaT細胞體外增殖，同時在mRNA水平下調K17、VEGF的表達 ，在蛋白水平下調K17、P?STAT3、VEGF的表達。本研究結果只能初步為葫蘆素治療銀屑病提供部分實驗和理論依據，但其能否成為該病治療的一種新型藥物，尚需進一步研究。

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Effects of cucurbitacin I onin vitroproliferation of HaCaT cells and the expression of keratin 17,signal transducer and activator of transcription 3 and vascular endothelial growth factor

Yao Qiunan,Wei Zhiping,Liu Yanqun
Department of Dermatology,The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,Jiangsu,China（The current affiliation of the third author was Jiangsu Medical Association）

Wei Zhiping,Email:xzwzp1961@aliyun.com

ObjectiveTo evaluate effects of cucurbitacin I onin vitroproliferation of HaCaT cells and the expression of keratin 17（K17）,signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）and vascular endothelial growth factor（VEGF）in cultured HaCaT cells.MethodsIn vitrocultured HaCaT cells were divided into 6 groups to be treated with cucurbitacin I at different concentrations of 0.0125,0.025,0.05 and 0.1 μmol/L （0.0125,0.025,0.05 and 0.1 μmol/L cucurbitacin I groups）,DMEM containing the same volume of DMSO as 0.1 μmol/L cucurbitacin I（DMSO group）,DMEM（negative control group）and 10 nmol/L calcipotriol（positive control group）,respectively.Cell counting kit?8（CCK8）assay was performed to assessin vitrocellular proliferative activity after 12 ?,24 ?,36 ?hour treatment,reverse transcription（RT）?PCR to measure the mRNA expression of K17 and VEGF in HaCaT cells after 24?hour treatment,and Western blot analysis to determine the protein expression of K17,STAT3,phosphorylated?STAT3（p?STAT3）and VEGF after 24?hour treatment.Statistical analysis was carried out by one?way analysis of variance（ANOVA）,repeated measures ANOVA,Student?Newman?Keuls（SNK）?qtest and Pearson correlation analysis.ResultsThe proliferative activity of HaCaT cells started to decrease after 12?hour treatment with cucurbitacin I at the concentration of 0.0125 μmol/L.When the concentration of cucurbitacin I increased up to 0.1 μmol/L,the cell proliferation rates were inhibited by 43.00% ± 2.11%and 48.98% ± 2.27%after 24?and 36?hour treatment respectively.Compared with the negative control group,cucurbitacin I at different concentrations all could inhibitin vitroproliferation of HaCaT cells（allP＜ 0.05）,and the inhibitory effects increased gradually with the increase of cucurbitacin I concentration and treatment duration.After 24?hour treatment,the mRNA expression of K17 and VEGF and the protein expression of K17,VEGF and P?STAT3 were significantly decreased along with the increase of concentration of cucurbitacin I（allP＜ 0.05）.ConclusionCucurbitacin I can inhibitin vitroproliferation of HaCaT cells,and down?regulate the mRNA expression of K17 and VEGF and protein expression of K17,VEGF and P?STAT3.

Cucurbitacins;Keratin?17;STAT3 transcription factor;Vascular endothelial growth factors;HaCaT cells

魏志平，Email：xzwzp1961@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.010

2016?09?06）

（本文編輯：顏艷）