1型神經纖維瘤病NF1基因突變檢測

吉津 郭琴 章若畫 李明

210000南京中醫藥大學附屬江蘇省中醫院皮膚科（吉津、郭琴、章若畫）；上海交通大學附屬新華醫院皮膚科（李明）

1型神經纖維瘤病NF1基因突變檢測

吉津 郭琴 章若畫 李明

210000南京中醫藥大學附屬江蘇省中醫院皮膚科（吉津、郭琴、章若畫）；上海交通大學附屬新華醫院皮膚科（李明）

目的檢測1例1型神經纖維瘤病（NF1）患者NF1基因的突變。方法采用PCR和DNA測序法檢測1例NF1患者、2例直系親屬及100例無親緣關系的正常人NF1基因突變。結果在NF1患兒中檢測到1個移碼突變c.3822delC，患者直系親屬及100例無親緣關系的正常對照均未檢測到上述突變。結論在該例NF1患兒中新發現1個NF1基因移碼突變c.3822delC不是罕見的單核苷酸多態性，可能是致病突變，通過影響NF1基因的功能致病。

神經纖維瘤病1型；基因，神經纖維瘤病1型；突變

目前認為1型神經纖維瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1，OMIM：162200）主要是由NF1基因突變所致［1］。本研究通過PCR及DNA測序法檢測1例NF1患兒的NF1基因突變情況。

一、病例與方法

1.臨床資料：患兒男，2歲；1月齡時軀干部出現咖啡斑，逐漸增大增多。發育欠佳，語言能力較差。皮膚科檢查：軀干、四肢未捫及皮下結節，全身遍布咖啡色斑，腋下散在雀斑樣痣皮損。診斷：NF1。患兒為散發病例，家族中只有1例患病，患兒父母正常，非近親婚配，無相同疾病家族史。本研究經過江蘇省中醫院醫學倫理委員會批準，患兒監護人及正常對照者均簽署知情同意書。

2.DNA提取：抽取患兒及患兒父母的靜脈血3 ml，放置于5 ml EDTA抗凝管中，-80℃儲存。采用鹽析法提取基因組DNA，質控標準：DNA濃度 ＞ 100 ng/μl，總量 ＞ 5 μg，A260/A280比值范圍在1.8～2.0之間。同時提取100例無親緣關系、門診確診無NF1病史的正常人基因組DNA作為對照，以排除基因的多態性。

3.引物設計及PCR擴增：利用（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫獲得NF1基因組序列，應用Primer 5.0軟件設計NFI基因外顯子引物：擴增第28號外顯子正向引物5′?ATTCAGTATTCGCTGAGTTCC?3′；反向引物5′?TACCTATTAG CCTCTTTCCCT?3′，PCR反應體系為30 μl：ddH2O 16 μl，10 × 緩沖液 3 μl，dNTP 混合物（10 μmol/L）3 μl，MgCl22 μl，引物 F（10 μmol/L）1.5 μl，引物R（10 μmol/L）1.5 μl，Ex Taq 1 μl，模板DNA 2 μl。PCR反應在Biomometra PCR儀（德國Biometra公司）上進行，采用Touchdown反應程序。預變性94℃5 min，變性94℃30 s，退火64℃30 s、延伸72℃60 s，前14個循環每循環退火溫度下降0.5℃，14個循環后降至57℃，再以57℃為退火溫度進行31個循環，延伸72℃5 min。

4.DNA測序：PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證、純化后測序，用ABI 3130遺傳分析儀進行序列分析，通過Chromas V2.23軟件比對分析測序數據。用chromas軟件（版本2.0）分析基因序列，確定突變位點。

圖1 1型神經纖維瘤病（NF1）基因突變 患者NF1基因存在移碼突變，即c.3822delC（p.F1275SX10）。對照為患者父親NF1基因序列。圖中箭頭所示為突變位點

二、結果

發現1個移碼突變，c.3822delC（圖1）。擴增cDNA進一步檢測，確實發生單堿基缺失導致移碼突變。在患兒6例正常的直系家屬及100例無血緣關系的正常對照中均未檢測到上述突變，證明其不是罕見的單核苷酸多態性（SNP）。

三、討論

NF1基因的外顯率為100%，意味著所有攜帶NF1突變的患者均會發生NF1。超過92%符合NIH診斷標準的NF1患兒通過廣泛的基因測序均能檢測到NF1突變［2?3］。當成年患者在臨床上僅表現為牛奶咖啡斑及腋窩散在雀斑而不伴有神經纖維瘤時，分子檢測對于NF1的確診有幫助。此種符合NF1診斷標準具有輕微的顯型患者可能是Legius綜合征，其突變基因為SPRED1［4］。Leguis綜合征不會出現神經纖維瘤及眼部Lisch結節。相似的癥狀源于兩者不同的受累基因編碼同一反應通路的蛋白，缺乏腫瘤生長是二者很重要的不同點。約2%臨床符合NF1診斷標準的患者實際上包含SPRED1突變［5］，意味著有必要對臨床高度懷疑或者確診為NF1的患者進行NF1及SPRED1基因篩查，作為確診NF1的必要條件。因為二者的預后不同，臨床的隨訪程度會有相應的差別。

目前NF1基因已報道1 382個突變，包括錯義突變、無義突變、剪切突變、插入突變、缺失突變及重復片段等多種類型。其中插入、缺失導致的移碼突變占所有突變類型的54%，剪切突變占21%。說明本病主要是由于NF1基因突變后單倍體效應不足所致［6］。本文結果發現1個移碼突變，第28號外顯子c.3822delC，第1275位氨基酸之后10位提前形成終止密碼子，很可能對蛋白質的結構和功能產生較大影響。該突變位點既往未見報道，為NF1新的突變位點。NF1基因具有較高的突變頻率。據統計，接近一半的患者發生的突變為自身新發突變，無家族遺傳史［7］。散發的種系NF1基因突變表現出性別偏倚，大多數（＞80%）的新突變是父系來源的，而大多數所謂的染色體微缺失似乎是母系來源的［8］。染色體微缺失包括整個NF1基因及其翼區。目前僅有2種NF1基因關于基因型和表現型的關系是已知的：1種是NF1基因染色體微缺失，可導致嚴重的1型神經纖維瘤病，表現為更高的神經纖維瘤風險，軀體形態異常及學習障礙；第2種為17外顯子3?bp的框內缺失，多數患者表現為較輕的臨床癥狀，伴有NF1典型的色素沉著特征（牛奶咖啡斑、腋窩及腹股溝雀斑）和Lisch結節，但并不會進展出皮膚或臨床可檢測出的從狀神經纖維瘤［8］。除了生殖細胞發生的種系突變外，NF1還存在體細胞的突變，導致患者出現“鑲嵌現象”（節段型1型神經纖維瘤病）或局限于身體某一部位的1型神經纖維瘤病。

本研究發現的突變豐富了NF1突變譜，為疾病的機制研究和基因型與表現型關系的研究提供了一定的依據，并為進行遺傳咨詢及產前診斷提供了一定的幫助。

［1］Ahlawat S,Fayad LM,Khan MS,et al.Current whole?body MRI applications in the neurofibromatoses:NF1,NF2,and schwanno?matosis［J］.Neurology,2016,87（7 Suppl 1）:S31 ?39.DOI:10.1212/WNL.0000000000002929.

［2］Ahlawat S,Fayad LM,Khan MS,et al.Current whole?body MRI applications in the neurofibromatoses:NF1,NF2,and schwanno?matosis［J］.Neurology,2016,87（7 Suppl 1）:S31 ?39.DOI:10.1212/WNL.0000000000002929.

［3］Messiaen L,Callens T,Mortier G,et al.Exhaustive mutation analysis of the NF1gene allows identification of 95%of mutations and reveals a highfrequency of unusual splicing defects.Hum Mutat 2000,15（6）:541?555.DOI:10.1002/1098?1004（200006）15:6＜541::AID?HUMU6＞3.0.CO;2?N.

［4］Brems H,Chmara M,Sahbatou M,et al.Germline loss?of?function mutations in SPRED1 cause a neurofibromatosis 1?like phenotype［J］.NatGenet,2007,39（9）:1120?1126.DOI:10.1038/ng2113.

［5］Messiaen L,Yao S,Brems H,et al.Clinical and mutational spectrum of neurofibromatosis type 1?like syndrome［J］.JAMA,2009,302（19）:2111?2118.DOI:10.1001/jama.2009.1663.

［6］Brems H,Beert E,de Ravel T,et al.Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1［J］.Lancet Oncol,2009,10（5）:508?515.DOI:http://dx.doi.org/10.1016/S1470?2045（09）70033?6.

［7］Beert E,Brems H,Renard M,et al.Biallelic inactivation of NF1 in a sporadic plexiformneurofibroma［J］.Genes Chromosomes Cancer,2012,51（9）:852?857.DOI:10.1002/gcc.21969.

［8］Jouhilahti EM,Peltonen S,Heape AM,et al.The pathoetiology of neurofibromatosis 1［J］.Am J Pathol,2011,178（5）:1932?1939.DOI:10.1016/j.ajpath.2010.12.056.

Mutation detection of NF1 gene in a patient with neurofibromatosis type 1

Ji Jin,Guo Qin,Zhang Ruohua,Li Ming

Department of Dermatology,Jiangsu Province Hospital of TCM,Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing 210023,China（Ji J,Guo Q,Zhang RH）;Department of Dermatology,Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Nanjing 200092,China（Li M）

Li Ming,Email:aypyslm@163.com

ObjectiveTo detect NF1 gene mutations in a patient with neurofibromatosis type 1（NF1）.MethodsPolymerase chain reaction（PCR）and DNA sequencing were performed to detect mutations of the NF1 gene in a patient with NF1,his parents and 100 unrelated healthy controls.ResultsA novel frameshift mutation（c.3822delC）was identified in the patient,but not found in his parents or the unrelated healthy controls.ConclusionThe novel frameshift mutation（c.3822delC）found in the patient is not a rare single nucleotide polymorphism（SNP）,and may be a causative mutation for NF1 by affecting the function of the NF1 gene.

Neurofibromatosis 1;Genes,neurofibromatosis 1;Mutation

李明，Email：aypyslm@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.013

2016?06?22）

（本文編輯：顏艷）