不同程度精索靜脈曲張不育患者精索靜脈高位結扎術后精子DNA碎片分析

曲仕浩，徐楗熒，羅英，陳取欣

（1.廣東省珠海市婦幼保健院 泌尿外科，廣東 珠海 519000；2.廣東省陽江市婦幼保健院 普外科，廣東 陽江 529500）

不同程度精索靜脈曲張不育患者精索靜脈高位結扎術后精子DNA碎片分析

曲仕浩1，徐楗熒1，羅英1，陳取欣2

（1.廣東省珠海市婦幼保健院 泌尿外科，廣東 珠海 519000；2.廣東省陽江市婦幼保健院 普外科，廣東 陽江 529500）

目的分析不同程度精索靜脈曲張（VC）不育患者行精索靜脈高位結扎術后精子DNA碎片的情況。方法不同程度VC不育患者57例。其中，診斷為2級患者27例，3級患者30例。所有患者行精索靜脈高位結扎術前1個月及術后3個月檢測并計算精子DNA碎片指數（DFI）。結果57例VC不育患者均行腹腔鏡雙側精索靜脈高位結扎術。VC 2級和3級患者行手術治療后精子DFI與術前比較均值降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。治療前VC 2級和3級不育患者精子DFI比較差異無統計學意義（P＞0.05）；治療后2級患者精子DFI低于3級患者（P＜0.05），DFI改善情況優于3級患者（P＜0.05）。結論腹腔鏡精索靜脈高位結扎術能夠改善VC不育患者精子DNA碎片情況，對于2級患者效果更佳。

精索靜脈曲張；精索靜脈高位結扎術；精子DNA碎片；不育

精索靜脈曲張（varicocle，VC）是指精索內蔓狀靜脈叢的異常伸長、擴張和迂曲。多見于青壯年，發病率約占男性人群的10.0%～15.0%；在不育男性中發病率為25.0%～40.0%，是引起男性不育癥的主要病因之一[1-2]。研究顯示[3-5]，VC引起睪丸局部溫度增高，氧自由基（reactive oxygen species，ROS）過多和抗氧化酶的平衡失調，造成精子DNA單鏈和雙鏈的斷裂，導致精子DNA碎片增多而影響男性生育。精子DNA碎片指數（DNA fragmentation index，DFI）是一個穩定性高的指標，VC患者的精子活動力密度和形態分析可在正常范圍，但是精子DFI明顯高于正常。20世紀90年代開始腹腔鏡下進行精索內靜脈高位結扎手術，手術創傷小、療效好、恢復快，目前已廣泛應用于臨床[6-7]。本研究分析不同程度VC不育患者行精索靜脈高位結扎術后精子DNA碎片的情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年2月-2016年8月在珠海市婦幼保健院和陽江市婦幼保健院就診的VC不育患者共57例。診斷標準[8]：按照《2014版中國泌尿外科臨床診斷治療指南》將精索靜脈曲張分為4級。0級：未表現出VC癥狀，Valsalva試驗未出現，經彩色多普勒檢查發現輕微的VC，靜脈管徑超過1.8 mm；1級：觸診不明顯，但Valsalva試驗時可出現；2級：在觸診時極易觸及擴張靜脈，但肉眼不能看見；3級：患者站立時肉眼能看到擴張靜脈在陰囊皮膚突現，如團狀蚯蚓，容易觸摸到。納入標準：①術前檢查DFI＞20.0%；②至少一側為2級及以上VC；③不育年限≥2年；④無其他不育原因。依據診斷標準及納入標準，進入本研究的VC 2級患者27例，年齡（32.6±4.9）歲，不育年限（3.3±1.5）年；VC 3級患者30例，年齡（33.7±6.5）歲，不育年限（3.8±1.8）年。兩組患者年齡及不育年限比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者均無家族遺傳病史，無其他內、外科疾病及手術禁忌。

1.2 手術方法

所有患者均行腹腔鏡雙側精索靜脈高位結扎術。術前常規留置導尿管，取平臥位，行氣管插管全身麻醉。麻醉滿意后，術區常規消毒、鋪巾。于臍下緣作一長約1.5 cm切口，置入氣腹針，注入二氧化碳CO2氣體建立氣腹，設定腹腔壓力13～15 mmHg。取15°頭低腳高位，于臍下緣切口置入Trocar后進入腹腔鏡，接監視器，觀察雙側腹膜后精索靜脈，于左、右側髂前上棘與臍連線中點分別作一長約0.5 cm切口并置入Trocar，距內環口約3.0 cm處將腸管推向近心端，充分暴露術野，用雙極電凝鉤切開曲張靜脈表面后腹膜，分離出精索動脈后，充分游離曲張的精索靜脈并用4號絲線于近心端及遠心端分別將其結扎，觀察術野無出血后，退出腹腔鏡，將CO2氣體充分釋放，術后4 h拔除尿管自行排尿。

1.3 實驗方法

應用精子染色質擴散法（sperm nucleus DNA kit，SCD）檢測精子核DNA完整性，試劑盒購自深圳華康生物醫學工程有限公司。步驟簡述如下：①試劑盒取出放置室溫平衡30～60 min，將低熔點瓊脂糖管的凝膠完全熔解備用；②用精子稀釋液將精液密度調至5～10×106/ml，取60μl稀釋的精液標本加入到低熔點瓊脂糖管中混勻；③將含有精子的低熔點瓊脂糖懸浮液取出30μl滴加到載玻片，蓋上蓋玻片；④將預處理后的載玻片置入4℃冰箱冷卻4 min，移走蓋玻片，迅速將預處理的載玻片放入變性液中7 min，蒸餾水中浸泡5 s，再浸入裂解液中反應20 min；⑤反應完畢，將預處理的載玻片浸入洗滌液3 min，再依次浸入70%乙醇、90%乙醇、無水乙醇溶液中脫水各2 min；⑥將預處理的載玻片自然晾干后用瑞氏染色劑進行染色，顯微鏡下觀察。

精子DNA碎片結果判定標準：根據暈環與精子頭部直徑比例，分為大暈環精子（單側暈環寬度≥2/3精子頭部最小直徑）、中暈環精子（1/4精子頭部最小直徑＜單側暈環寬度≤2/3 精子頭部最小直徑）、小暈環精子（單側暈環寬度≤1/4精子頭部最小直徑）、無暈環精子以及退化精子。精子DFI計算公式[9]：DFI=（小暈環精子＋無暈環精子＋退化精子）/計數精子總數×100.0%。

1.4 療效評判標準

所有患者均于行精索靜脈高位結扎術前1個月及術后3個月檢測DFI，以精子DFI改善率評價療效。DFI改善率[10]=[（治療前DFI-治療后DFI）/（治療前DFI-23.0%）]×100.0%。治療后改善率＜30.0%為無效，30.0%≤改善率＜60.0%為有效，60.0%≤改善率＜90.0%為顯效，DFI≤23.0%或改善率≥90.0%為治愈。

1.5 統計學方法

數據應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間正態分布資料比較用兩樣本t檢驗，同級手術前后比較用配對t檢驗；計數資料以率（%）表示，兩組間比較用χ2檢驗。檢驗標準取雙側α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

57例VC不育患者均行腹腔鏡雙側精索靜脈高位結扎術，鏡下觀察精子核DNA完整性（附圖），評判精子DNA碎片結果并計算DFI。2級和3級患者行手術治療后精子DFI與術前比較均值降低，經配對t檢驗分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。治療前VC 2級和3級不育患者精子DFI比較差異無統計學意義（P＞0.05）；治療后2級患者精子DFI低于3級患者，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。治療后2級患者精子DFI改善情況優于3級患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。

附圖 精子核DNA完整性Attached fig. Sperm nucleus DNA integrity

表1 不同程度VC不育患者手術治療前后精子DFI比較 （%，±s）Table 1 Comparison of sperm DFI before and after surgical treatment in patients with different degrees of VC infertility （%，±s）

表1 不同程度VC不育患者手術治療前后精子DFI比較 （%，±s）Table 1 Comparison of sperm DFI before and after surgical treatment in patients with different degrees of VC infertility （%，±s）

組別 治療前精子DFI 治療后精子DFI t值 P值2級（n =27） 37.0±7.6 26.9±5.9 12.75 0.000 3級（n =30） 37.5±6.9 30.7±6.4 14.95 0.000 t值 0.28 2.29 P值 0.782 0.026

表2 不同程度VC不育患者手術治療后精子DFI改善情況分析 例（%）Table 2 Improvement of sperm DFI after surgical treatment in patients with different degrees of VC infertility n（%）

3 討論

目前常規精液分析不能全面評估男性的生育能力，而精子DNA碎片化程度被認為是一個新的預測生育能力的指標，間接反映精子遺傳物質的完整性，與生育能力呈負相關，且不隨季節發生變化[11-12]。目前所應用的判定方法是觀察特征性的光暈，沒有DNA碎片的精子在經過酸變性和去掉核蛋白后DNA擴散形成光暈，而帶有DNA碎片化的精子不會產生這種光暈，根據光暈的有無和大小判斷精子DNA碎片化的程度。

精子DNA碎片化發生機制：①精子發生過程中異常染色質包裝：染色質是由一條DNA分子纏繞無數核小體核心而連成一條串珠樣長鏈形成的核蛋白纖維。精子發生過程中染色質核蛋白經歷了從組蛋白-過渡蛋白-魚精蛋白的轉變，魚精蛋白對于維持精子正常形態和DNA完整性起到至關重要的作用，其含量與精子DFI呈負相關[13]。魚精蛋白自身缺陷或功能異常，精子染色質濃縮過程異常，導致精子DFI指數升高。而且，內源性核酸酶在精子發生過程中也參與了染色質的組裝[14]；②ROS增多：精子DNA對ROS極為敏感，生理濃度的ROS有利于精子的受精，ROS過多和抗氧化酶的平衡失調，會造成精子DNA單鏈和雙鏈的斷裂，導致精子DNA損傷[15]。受損傷的精子DNA更容易受到ROS的攻擊，形成惡性循環，最終使精子DNA損傷逐漸加重，畸形精子增加影響男性生育。研究顯示[16]，不育癥患者精液中ROS水平及精子DNA損傷的程度明顯高于正常人。而且，精液中異常增多的白細胞也可以誘導精子產生過量的ROS，損傷精子DNA結構的完整性；③凋亡異常：凋亡是細胞死亡方式中的一種，是指細胞的程序化死亡。在一定的生理和病理條件下，遵循自身的程序，自動結束其生命的過程，Fas、Bcl-x和p53是調控細胞凋亡的主要基因[17]。當控制凋亡的基因異常表達，細胞凋亡發生異常，不能及時去除DNA受損的精子，導致精子DNA碎片化。而且，精子DNA損傷影響精子密度，這部分精子比例增高時精子密度降低，精子的質量也受到影響，引起受精功能障礙及胚胎發育異常等，導致男性不育[18]。

目前，已公認VC可影響男性生育，但其病理和生理機制尚未十分明確。VC引起精索靜脈內血液滯留，睪丸局部缺氧、代謝性酸中毒、無氧酵解增強，腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）被分解為次黃嘌呤，并在黃嘌呤氧化酶的作用下產生ROS。VC患者睪丸組織中存在高水平的脂質過氧化，ROS的過度產生導致精子DNA碎片增多，引起不育[19]。而且，VC也會導致生精細胞凋亡異常及精子凋亡相關表型增加，包括精子質膜磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻、線粒體功能障礙及精子DNA損傷[20]。研究顯示[21]，VC患者行精索靜脈高位結扎術能改善精液質量和睪丸容積，精液參數明顯改善，精子DNA碎片明顯減少，精子DFI降低后能夠有效提高女方受孕率。本研究顯示，2級和3級精索靜脈曲張不育患者術前存在不同程度的精子DNA碎片，行腹腔鏡精索靜脈高位結扎術后精子DFI降低，精子DNA碎片情況得到改善。與3級VC不育患者比較，2級患者治療效果更為顯著。

本研究存在的不足之處：①常規精液分析是用于判斷男性生育力最基本的臨床指標，但是部分患者手術前的精液分析是正常的，本研究未對患者行手術治療前后精液常規的比較；②VC 1級患者無臨床不適癥狀，即使已影響生育，能夠接受腹腔鏡手術的患者較少，所以本研究未納入此部分患者；③由于進行研究的時間短，樣本量較少，后續需擴大樣本量；④評價VC不育患者手術治療效果具有社會價值的方法是女方妊娠情況，對于妊娠率、胎兒畸形率及新生兒活產率等觀察指標，已納入后續的研究中。

[1]郭應祿, 胡禮泉. 男科學[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2005:1623-1631.

[1]GUO Y L, HU L Q. Male science[M]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2005: 1623-1631. Chinese

[2]FRENCH D B, DESAI N R, AGARWAL A. Varicocele repair:does it still have a role in infertility treatment[J]. Curr Opin Obstet Gynecol, 2008, 20(3): 269-274.

[3]ZINI A, KAMAL K, PHANG D, et al. Biologic variability of sperm DNA denaturation in infertile men[J]. Urology, 2001, 58(2): 258-261.

[4]ALLAMANENI S S, NAUGHTON C K, SHARMA R K, et al.Increased seminal reactive oxygen species levels in patients with varicoceles corelate with varicocele grade but not with testis size[J]. Fertil Steril, 2004, 82(6): 1684-1686.

[5]AGARWAL A, MAKKER K, SHARMA R. Clinical relevance of oxidative stress in male factor infertility: an update[J]. Am J Reprod Immunol, 2008, 59(1): 2-11.

[6]吳在德, 吳肇漢. 外科學[M]. 第7版. 北京: 人民衛生出版社,2008: 700.

[6]WU Z D, WU Z H. Surgery[M]. 7th ed. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2008: 700. Chinese

[7]朱汝健, 陳安屏, 張忠, 等. 經臍單孔雙通道腹腔鏡精索靜脈高位結扎術[J]. 中國內鏡雜志, 2014, 20(4): 394-397.

[7]ZHU R J, CHEN A P, ZHANG Z, et al. Umbilical laparoendoscopic single-site varicocelectomy: the two-trocar technique[J]. China Journal of Endoscopy, 2014, 20(4): 394-397. Chinese

[8]那彥群, 葉章群, 孫穎浩, 等. 中國泌尿外科臨床診斷治療指南(2014版)[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2013: 597-598.

[8]NA Y Q, YE Z Q, SUN Y H, et al. Clinical diagnosis and treatment of Department of Urology in China (2014 Edition)[M]. Beijing:People’s Medical Publishing House, 2013: 597-598. Chinese

[9]韓小克, 苑輝, 關立軍, 等. 精子DNA碎片與精液各參數的相關性分析[J]. 中國計劃生育和婦產科, 2016, 8(10): 59-62.

[9]HAN X K, YUAN H, GUAN L J, et al. Analysis on correlation between sperm DNA fragments and semen parameters[J]. Chinese Journal of Family Planning ＆Gynecotokology, 2016, 8(10): 59-62. Chinese

[10]吳駿, 崔云, 陳建偉, 等. “通精靈”方對精索靜脈曲張致男性不育患者精子DNA碎片率的影響[J]. 浙江中醫藥大學學報,2016, 40(5): 356-359.

[10]WU J, CUI Y, CHEN J W, et al. The prescription of “Tongjingling”on DFI caused by varicocele in male inferlility[J]. Journal of Zhejiang Chinese Medicine University, 2016, 40(5): 356-359.Chinese

[11]MALM G, HAUGEN T B, RYLANDER L, et al. Seasonal fluctuation in the secretion of the antioxidant melatonin is not associated with alterations in sperm DNA damage[J]. Asian J Androl, 2016, 19(1): 52-56.

[12]RYBAR R, MARKOVA P, VEZNIK Z, et al. Sperm chromatin integrity in young men with no experiences of infertility and men from idiopathic infertility couples[J]. Andrologia, 2009, 41(3):141-149.

[13]AOKI V W, MOSKOVTSEV S I, WILLIS J, et al. DNA integrity is compromised in protamine- deficient human sperm[J]. J Androl, 2005, 26(6): 741-748.

[14]SILLS E S, FRYMAN J T, PERLOE M, et al. Chromatin fluorescence characteristics and standard semen analysis parameters: correlations observed in andrology testing among 136 males referred for infertility evaluation[J]. J Obstet Gynaecol,2004, 24(1): 74-77.

[15]MOUSTAFA M H, SHARMA R K, THORNTON J, et al.Relationship between ROS production, apoptosis and DNA denaturation in spermatozoa from patients examined for infertility[J]. Hum Reprod, 2004, 19(1): 129-138.

[16]SMITH R, KAUNE H, PARODI D, et al. Extent of sperm DNA damage in spermatozoa from men examined for infertility.Relationship with oxidative stress[J]. Rev Med Chil, 2007,135(3): 279-286.

[17]SAKKAS D, MOFFATT O, MANICARDI G C, et al. Nature of DNA damage in ejaculated human spermatozoa and the possible involvement of apoptosis[J]. Biol Reprod, 2002, 66(4): 1061-1067.

[18]AMIRI I, GHORBANI M, HESHMATI S. Comparison of the DNA fragmentation and the sperm parameters after processing by the density gradient and the swim up methods[J]. J Clin Diagn Res, 2012, 6(9): 1451-1453.

[19]KOKSAL I T, USTA M, ORHAN I, et al. Potential role of reactive oxygen species on testicular pathology associated with infertility[J]. Asian J Androl, 2003, 5(2): 95-99.

[20]潘連軍, 高佃軍. 精索靜脈曲張與生精細胞凋亡[J]. 國外醫學:計劃生育/生殖健康分冊, 2016, 25(1): 9-11.

[20]PAN L J, GAO D J. Varicocele and apoptosis of spermatogenic cells[J]. Foreign Medical Sciences: Section of Family Planning/Reproductive Health, 2016, 25(1): 9-11. Chinese

[21]SMIT M, ROMIJN J C, WILDHAGEN M F, et al. Decreased sperm DNA fragmentation after surgical varicocelectomy is associated with increased pregnancy rate[J]. J Urol, 2013,189(1Suppl): S146-S150.

Analysis of the sperm DNA fragmentation in different degrees of varicocele infertility patients after high ligation of the spermatic vein

Shi-hao Qu1, Jian-ying Xu1, Ying Luo1, Qu-xin Chen2
(1.Department of Urology, Zhuhai Maternal and Children’s Hospital, Zhuhai, Guangdong 519000,China; 2.Department of General Surgery, Yangjiang Maternal and Children’s Hospital,Yangjiang, Guangdong 529500, China)

ObjectiveTo analyze the sperm DNA fragmentation in different degrees of varicocele (VC)infertility patients after high ligation of the spermatic vein.MethodsThere were 57 patients with different degrees of VC infertility patients. 27 patients had been diagnosed with level two VC, and 30 patients had been diagnosed with level three VC. All patients’ sperm DNA fragmentation index (DFI) were detected and calculated at preoperative one month and postoperative three months.Results57 VC infertility patients were all suffered from laparoscopic high ligation of the spermatic vein on both sides. There was no statistically difference on preoperative sperm DFI between level two and level three patients (P＞ 0.05). All patients’ sperm DFI were decreased after laparoscopic (P＜ 0.05), and level two VC infertility patients had signi fi cant greater progress than level three patients(P＜ 0.05).ConclusionLaparoscopic high ligation of the spermatic vein can effectively improve VC infertility patients sperm DFI. It would be better for level two VC infertility patients.

varicocle; high ligation of the spermatic vein; sperm DNA fragmentation; infertility

R697.24

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2017.08.013

1007-1989（2017）08-0061-05

2016-12-19

徐楗熒，E-mail：qsh0601@sohu.com

（吳靜 編輯）