組織蛋白酶S對小鼠主動脈環(huán)微管腔形成的影響

白莉艷，類延娜，成憲武，李香

基礎與實驗研究

組織蛋白酶S對小鼠主動脈環(huán)微管腔形成的影響

白莉艷，類延娜，成憲武，李香

目的：探討組織蛋白酶S (CatS)對小鼠主動脈環(huán)微管腔形成的影響。

方法：分別在C57BL6野生型雄性小鼠（CatS+/+組）和CatS基因敲除雄性小鼠（CatS-/-組）建立下肢缺血模型，每組8只，分別測定術前、術后即刻、1天、4天、7天、14天、21天血流進行比較分析。再將CatS+/+組小鼠，分為正常對照亞組、選擇性CatS抑制劑（LHVS）亞組、非選擇性CatS抑制劑（E64d）亞組和基質金屬蛋白酶（MMP）抑制劑（GM6001）亞組，每組2只，觀察小鼠主動脈環(huán)微管腔形成情況。用免疫熒光法異硫氰酸熒光素（FITC）-CD31標記微管腔形成情況。

結果：（1）CatS-/-組小鼠明顯抑制下肢血流的恢復。用激光多普勒超聲血流儀檢測下肢血流，缺血與非缺血下肢血流比值統(tǒng)計結果顯示：CatS-/-組小鼠術后第7、14、21天缺血下肢血流恢復均明顯慢于CatS+/+組（P均＜0.05）。（2）CatS-/-組小鼠的主動脈環(huán)中生長出來的微管腔與CatS+/+組小鼠比較明顯減少，兩者有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。（3）LHVS、E64d以及GM6001亞組分別與正常對照亞組比較，均明顯抑制主動脈環(huán)微管腔的形成，兩者差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。（4）主動脈環(huán)培養(yǎng)形成的微管腔由內皮細胞組成。

結論：CatS在缺血性血管再生中發(fā)揮有益的作用，不但增加了主動脈環(huán)微管腔形成的數(shù)量，并且促進了缺血下肢的血流恢復。這些結果為尋找下肢缺血性血管再生提供了理論依據(jù)。

組織蛋白酶類；微管腔；血管再生

下肢動脈硬化性疾病（LEAD）其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。國外研究顯示,LEAD 患者伴有持續(xù)性疼痛者占28%，需要血管重建或截肢手術者占8.2%。更觸目驚心的臨床研究報道，LEAD嚴重肢體缺血患者1年病死率約25%，截肢率高達45%[1]。2002年，血管內介入治療問世后，給LEAD的臨床治療帶來希望，但是，術后早中期25%～45%支架內再狹窄等，束縛了LEAD介入治療的廣泛臨床應用[2]。被譽為分子搭橋術的血管再生醫(yī)學引起全世界醫(yī)學專家的注目。然而，缺血后血管再生及細胞治療的分子機制尚不明確。因此，尋找下肢缺血性血管再生的治療靶點、明確其作用機制、開發(fā)有效安全的治療措施成為各國醫(yī)學專家共同的任務和亟需解決的難題。本研究旨在觀察組織蛋白酶S （CatS）對小鼠主動脈環(huán)微管腔形成的影響，為尋找下肢缺血性血管再生的治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

動物來源及分組：8周齡C57BL6野生型雄性小鼠（CatS+/+組）和8周齡CatS基因敲除雄性小鼠（CatS-/-組）由日本名古屋大學動物實驗室提供，體重為21～25 g。第一組實驗：分別在CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠建立下肢缺血模型，每組8只。分別測定術前、術后即刻、1天、4天、7天、14天、21天血流進行比較分析。第二組實驗：再將CatS+/+組小鼠，分為正常對照亞組、選擇性CatS抑制劑（LHVS）亞組、非選擇性CatS抑制劑（E64d）亞組和基質金屬蛋白酶（MMP）抑制劑（GM6001）亞組，每組2只，觀察小鼠主動脈環(huán)微管腔形成情況。用免疫熒光法異硫氰酸熒光素（FITC）-CD31標記微管腔形成情況。

1.2 實驗方法

下肢缺血模型的建立：首先分離股神經(jīng)后結扎股動脈根部，剝離股動脈三個主要分支并結扎，然后切除股動脈主干及其分支，建立下肢缺血模型。激光多普勒血流儀測定下肢血流：采用Laser Doppler Perfusion Imager （Lisca AB 公司）的激光多普勒血流儀，測量術前與術后不同時間點的缺血側（左側下肢）和對側非缺血側（右側下肢）的血流灌注情況。每次測量之前，給予小鼠腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）進行麻醉，麻醉后采取仰臥位，置于37℃條件下15 min。仰臥位掃描之后，存儲圖像，圖像存儲形式為整個雙下肢區(qū)域的二維圖像，經(jīng)過PIMⅡPatch Test WIZARD軟件分析，血流灌注情況表示平均的激光多普勒血流值。用每只小鼠同一時間點的缺血側與非缺血側的血流灌注情況的比值表示其缺血下肢血流恢復情況。

1.3 小鼠主動脈環(huán)血管新生實驗步驟

取材：心臟采血處死小鼠，體式顯微鏡下鈍性分離小鼠胸主動脈，使用顯微剪和眼科鑷小心剔除血管周圍脂肪及結締組織。將分離的主動脈轉移至預冷的無血清培養(yǎng)基中[3]。消化：取下胸主動脈后，將其置于預先復溫的Ⅱ型膠原酶（ 2 g/L） 中，放入37℃ 培養(yǎng)箱消化6～7 min，主動脈內插入球囊，將內皮細胞層朝外。饑餓：盡可能將血管均勻地剪成約1 mm長的動脈環(huán)。取出動脈環(huán)放入無血清培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中饑餓過夜。Ⅰ型膠原包埋主動脈環(huán)：預冷的無血清培養(yǎng)基稀釋膠原至終濃度為 1 g/L，使用 NaOH（ 200 g/L） 調整 pH 至 7.4。Ⅰ型膠原以約200 μl/孔包被預冷的24 孔板，將動脈環(huán)包埋入液態(tài)基質膠。24孔板在室溫平衡10 min后放入37℃培養(yǎng)箱，孵育30 min，待膠原凝固后，正常對照亞組和LHVS亞組、E64d亞組和GM6001亞組，均加入DMEM +血管內皮生長因子（ VEGF，50 ng /ml） 100 μl /孔覆蓋膠原表面，隔天換液，培養(yǎng)7天。其中，LHVS濃度為5 nmol/L，E64d濃度為 10 μmol/L，GM6001濃度為 20 μmol/L。在倒置顯微鏡下觀察主動脈環(huán)微管腔出芽面積（×200倍放大）。出芽面積用定量分析區(qū)域內血管每個圖像的像素所占的百分比表示。

1.4 主動脈環(huán)試驗

用分子遺傳學觀察血管生成的新方法，觀察內皮細胞組成的微血管網(wǎng)絡。CatS+/+小鼠反轉后的主動脈環(huán)，置于預先包被有Collagen type l膠原的6 cm的培養(yǎng)皿中，給予VEGF（最終濃度為50 ng/ml）+內皮基礎培養(yǎng)基-2（EBM-2）中培養(yǎng)7天。然后用免疫熒光法FITC-CD31標記微血管出芽情況。將1：100配成的FITC mouse anti-humenCD31置入后，37℃ 培養(yǎng) 90 min，0.01 M PBS（0.2 M Na2HPO411.5 g, NaH2PO4·2H2O 2.2 g, NaCl 80 g 溶于 1 000 ml水，pH=7.4）清洗3次，多聚甲醛溶液（4%PFA）主要由多聚甲醛、磷酸鹽、去離子水組成，pH=7.4，室溫浸泡10 min后， PBS清洗3次，玻片上涂4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI），將動脈環(huán)封片后熒光顯微鏡觀察[4]。

1.5 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析應用SPSS15.0分析系統(tǒng)，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（±sE）表示，用student的非配對T檢驗或Tukey post hoc test 雙因素多重統(tǒng)計學分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CatS+/+ 和CatS-/- 兩組小鼠缺血與非缺血下肢血流的動態(tài)變化（圖1）。

CatS-/-組小鼠明顯抑制下肢血流的恢復。觀察到術后即刻、術后1天血流明顯下降,術后第4天開始血流逐漸恢復，術后第7、14、21天CatS-/-組小鼠缺血下肢血流恢復均明顯慢于CatS+/+組（P均＜0.05）。

圖1 CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠缺血與非缺血下肢血流的動態(tài)變化（n=8）

2.2 CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠主動脈環(huán)微管腔形成（圖2）

CatS-/-組小鼠的主動脈環(huán)中生長出來的微管腔與CatS+/+組小鼠比較明顯減少，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.3 利用組織蛋白酶S抑制劑（LHVS，E64d）及MMP抑制劑（GM6001）觀察小鼠

主動脈環(huán)微管腔形成情況（圖3）。LHVS、E64d亞組以及GM6001亞組分別與正常對照亞組比較，明顯抑制主動脈環(huán)微管腔的形成，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

圖2 CatS+/+和CatS-/-兩組小鼠主動脈環(huán)微管腔形成（n=4，×200）

圖3 各亞組小鼠主動脈環(huán)微管腔形成情況（n=2，×200）

2.4 小鼠主動脈環(huán)的免疫熒光鑒定（圖4）。

倒置顯微鏡下觀察，綠色熒光為內皮細胞由FITC- CD31特異性標記，藍色熒光為DAPI染色的細胞核。在免疫組化中，CD31是主要用于證明內皮細胞的存在。結果表明：主動脈環(huán)培養(yǎng)以后形成的微管腔由內皮細胞組成

圖4 小鼠主動脈環(huán)的免疫熒光鑒定（×200）

3 討論

2004年，Cheng等[5，6]報道了CatS 在損傷性增生內膜及心力衰竭心肌中表達明顯增高，并在心血管重構中起著重要作用。此后，也發(fā)現(xiàn)CatS主要在血管平滑肌細胞膜外與ανβ3 整合素結合，調控平滑肌細胞的移動及浸潤功能[7]。藥物干預CatS可以抑制動脈斑塊形成及改善斑塊穩(wěn)定性[8]。這些研究結果提示，CatS參與動脈粥樣斑塊形成、發(fā)展、破裂和破裂后修復的全過程。以往的散在報道顯示：CatS一方面通過降解、失活成纖維細胞生長因子（BFGF）或分解4型膠原蛋白產(chǎn)生具有抗血管再生活性的血管抑制素，另一方面通過修飾以及釋放血管生長調節(jié)因子控制腫瘤血管新生[9]。2010年島田等日本學者利用基因敲除或藥物干預方法驗證骨髓來源內皮祖細胞-組織蛋白酶L 在角膜和脈絡膜血管再生過程中作用[10]。Urbich 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在內皮祖細胞中組織蛋白酶L高水平表達，并促使骨髓內皮祖細胞歸巢于缺血血管床中發(fā)揮了重要作用。以上研究結果揭示：CatS在動脈粥樣硬化性血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[12]，亦可能參與血管內皮細胞和內皮祖細胞的功能調控。下肢缺血性疾病最主要的病因為動脈粥樣硬化，因此，CatS可以成為參與缺血性血管再生的關鍵成員。

本研究結果表明：（1）CatS-/-組小鼠下肢血流的恢復明顯受到抑制。用激光多普勒超聲血流儀檢測下肢血流，缺血與非缺血下肢血流比值統(tǒng)計結果顯示：CatS-/-組小鼠術后第7、14、21天缺血下肢血流恢復均明顯慢于CatS+/+組（P均＜0.05）。（2）CatS-/-小鼠的主動脈環(huán)中生長出來的微管腔與CatS+/+小鼠比較明顯減少，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。（3）LHVS亞組、E64d亞組以及GM6001亞組分別與正常對照亞組比較，均明顯抑制主動脈環(huán)微管腔的形成，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。（4）主動脈環(huán)培養(yǎng)形成的微管腔由內皮細胞組成。目前較多的研究集中于CatS在動脈硬化性心血管疾病中的表達及其作用，而CatS在缺血性血管生成中表達及其作用尚少見報道[13]。本研究提示：CatS在缺血性血管再生中發(fā)揮有益的作用，不但增加了主動脈環(huán)微管腔形成的數(shù)量，并且促進了缺血下肢的血流恢復。這些結果為尋找下肢缺血性血管再生提供了理論依據(jù)。

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Impact of Cathepsins S on Aortic Ring-derived Micro Vascular Cavity Formation in Experimental Mice

BAI Li-yan, LEI Yan-na, CHENG Xian-wu, LI Xiang.
Department of Cardiology, Yanbian University Affiliated Hospital, Yanji (133000), Jilin, China
Corresponding Author: LI Xiang, Email:15526770377@163.com

Objective: To investigate the impact of cathepsins S (CatS) on aortic ring-derived micro vascular cavity formation in experimental mice.

Methods: Hindlimb ischemia model was established in CatS+/+and CatS-/-mice,n=8 in each group. The blood fl ow in hindlimb was measured before is chemic surgery; immediately and 1, 4, 7, 14, 21 days after surgery. CatS+/+mice were further divided into 4 subgroups: Normal control subgroup, Selective CatS inhibitor (LHVS) subgroup, Non-selective CatS inhibitor(E64d) subgroup and MMP inhibitor (GM6001) subgroup;n=2 in each subgroup. The mice aortic ring-derived micro vascular cavity formation was observed by FITC-CD31 immunof l uorescence method.

Results:①CatS-/-mice had inhibited blood fl ow recovery after is chemic surgery. Laser Doppler blood fl ow (LDBF)examination indicated that compared with CatS+/+group, CatS-/-group had slower hindlimb blood flow recovery,P＜0.05;②CatS-/-group had the less aortic ring-derived micro vascular cavities,P＜0.001.③Compared with Normal control subgroup,LHVS subgroup, E64d subgroup and GM6001 subgroup had suppressed micro vascular cavity formation, allP＜0.05.④Aortic ring-derived micro vascular cavity was composed by endothelial cells.

Conclusion: CatS plays a beneficial role in is chemic vascular regeneration in experimental mice; it is not only increasing aortic ring-derived micro vascular cavity formation, but also promoting blood flow recovery in is chemic hindlimb. Our finding provides a theoretical basis for new therapeutic target in is chemic vascular regeneration.

Cathepsins; Micro vascular cavity; Vascular regeneration

(Chinese Circulation Journal, 2017, 32:1015.)

國家自然科學基金資助項目（81660240）

133000 吉林省延吉市，延邊大學附屬醫(yī)院 心血管內科（白莉艷、成憲武、李香），重癥監(jiān)護病房（類延娜）

白莉艷 住院醫(yī)師 碩士研究生 主要從事組織蛋白酶與心血管疾病發(fā)病機制的研究 Email: zhongtian200330@163.com 通訊作者：李香Email:15526770377@163.com

R54

A

1000-3614（2017）10-1015-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.10.018

2016-11-01）

（編輯：王寶茹）