MiR-155對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響及機(jī)制研究

張紫微，楊麗霞，呂晉琳，王先梅， 楊智華，陸霓虹

MiR-155對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響及機(jī)制研究

張紫微，楊麗霞，呂晉琳，王先梅， 楊智華，陸霓虹

目的：觀察miR-155對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）表型轉(zhuǎn)換的影響并研究其可能的機(jī)制。

方法：原代培養(yǎng)小鼠VSMC，用不同濃度、時(shí)間AngⅡ作用于VSMC，然后用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)不同處理組miR-155表達(dá)的變化情況。用qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)及抑制表達(dá)miR-155后空白對(duì)照組、miR-155 mimics組、mimics陰性對(duì)照組、miR-155 inhibitors組、 inhibitors 陰性對(duì)照組的miR-155水平變化情況，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。用免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測(cè)過表達(dá)及抑制表達(dá)miR-155后空白對(duì)照組、AngⅡ組、miR-155 mimics組、AngⅡ+miR-155 mimics組、miR-155 inhibitors組、AngⅡ+miR-155 inhibitors組對(duì)AngⅡ激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）通路的影響。Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-155、使用雷帕霉素、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2抑制劑（U0126）后空白對(duì)照、AngⅡ組、miR-155 mimics組、AngⅡ+miR-155 mimics組、AngⅡ+ U0126組、AngⅡ+雷帕霉組AngⅡ促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)換的影響，檢測(cè)兩個(gè)收縮表型蛋白標(biāo)志物即平滑肌22α（SM22α）與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SM-actin），及一個(gè)合成表型蛋白標(biāo)志物骨橋蛋白（OPN）。

結(jié)果：與作用0 h或0 mol/L AngⅡ相比，AngⅡ作用于VSMC后AngⅡ以濃度、時(shí)間依賴方式降低miR-155的表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-155后可顯著減少基礎(chǔ)及AngⅡ促進(jìn)mTOR與ERK1/2通路激活作用，而轉(zhuǎn)染miR-155 抑制劑可進(jìn)一步增加基礎(chǔ)及AngⅡ促進(jìn)mTOR與ERK1/2通路激活作用。雷帕霉素、U0126及轉(zhuǎn)染miR-155均可抑制AngⅡ減少收縮表型蛋白標(biāo)志物SM22α與α-SM-actin的表達(dá)，同時(shí)抑制AngⅡ促進(jìn)合成表型蛋白標(biāo)志物OPN的表達(dá)。

結(jié)論：AngⅡ通過抑制miR-155表達(dá)促進(jìn)mTOR與ERK1/2激活促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)換。

核糖核酶類；血管緊張素Ⅱ；肌細(xì)胞，平滑肌

血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）作為一種非終末分化細(xì)胞，其表型具有可調(diào)控性。在不同刺激物作用下，VSMC可從收縮表型向合成表型（去分化表型）轉(zhuǎn)換，最終導(dǎo)致VSMC的增殖、遷移以及分泌活動(dòng)大大增強(qiáng)[1]。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)，在體內(nèi)作用相當(dāng)廣泛，多項(xiàng)研究證實(shí)其與AT1受體結(jié)合后，可進(jìn)一步激活下游通路導(dǎo)致VSMC的細(xì)胞表型發(fā)生改變，從而促進(jìn)VSMC的增殖、分泌及遷移活性[2,3]。微小 RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼約19～22個(gè)核苷酸長度以單鏈形式存在的小 RNA 分子。miRNA在心血管疾病病理過程中起著十分重要的調(diào)控作用[4,5]。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-155可能通過負(fù)調(diào)控含SH2區(qū)域的肌醇5'磷酸酶1（SHIP1）或編碼調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的調(diào)節(jié)亞基p85α（PIK3R1）等基因，激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[6-8]，而Zhu等[9]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-155可通過作用于靶基因絲裂原活化蛋白激酶3K10 （MAP3K10）抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的激活，從而抑制動(dòng)脈粥樣斑塊的免疫炎癥反應(yīng)。PI3K/AKT與MAPK兩大通路均參與AngⅡ?qū)SMC表型的調(diào)控機(jī)制，所以我們推測(cè)miR-155可能通過調(diào)控這兩條通路參與AngⅡ?qū)SMC表型的調(diào)控，在此項(xiàng)研究中，我們將以小鼠VSMC為研究對(duì)象，觀察miR-155是否參與AngⅡ?qū)SMC表型的調(diào)控過程并探索相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料：C57小鼠由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶，免疫組化試劑盒，trizol（Invitrogen，美國 ），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，PVDF膜，Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國 ），miR-155mimic及miRNA陰性對(duì)照（NC），miR-155 inhibitor及NC（上海，吉瑪），細(xì)胞裂解液，單克隆抗體：SM-22α（Proteintech,美國），α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SM-actin，Sigma，美國）, osteopontin（OPN，Proteintech，美國），磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（P-mTOR，CST, #2971，美國），哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR，Proteintech，美國），磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 （P-ERK1/2，Omega，美國）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白（ERK1/2，Omega，美國），二抗IgG-HRP（碧云天公司，江蘇，中國）， ECL顯色試劑盒。

VSMCS原代培養(yǎng)與傳代：無菌條件下取出C57小鼠主動(dòng)脈，用鑷子去除外膜及內(nèi)膜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次后將中膜剪成約1 mm3大小的組織塊，種植于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，加入含青霉素和鏈霉素及含10%胎牛血清的高糖細(xì)胞培養(yǎng)基3～5 ml，放入37℃恒溫箱培養(yǎng)，使組織塊浸于培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)5～7天可見細(xì)胞爬出，呈貼壁生長。將其用胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶或96孔培養(yǎng)板。選取第3代細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)及免疫組化染色方法進(jìn)行鑒定。第4～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）：Trizol法提取總RNA，取各不同濃度、時(shí)間AngⅡ處理的細(xì)胞500 ng總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄CDNA， 根 據(jù)Hairpin-it RT-PCR miRNA-155定量檢測(cè)試劑盒（上海，吉瑪）操作說明進(jìn)行逆 轉(zhuǎn) 錄 及PCR擴(kuò) 增。mmu-miR-155（F Primer:5'ACGCTCAGTTAATGCTAATTGTGAT'3；R Primer:5'TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT'3）U6（F Primer:5'ATTGGAACGATACAGAGAAGATT'3;R Primer:5'GGAACGCTTCACGAATTTG'3）。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)解離曲線，用軟件DataAssistTMv3.0軟件（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）以2-ΔΔCt方法來對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

qRT-PCR檢測(cè)miR-155表達(dá)水平的變化：按說明書分別將Lipofectamin 2000與miR-155 mimic及NC，miR-155 inhibitor及NC稀釋、混合，室溫下孵育20 min，使用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，mimic及inhibitor的最終轉(zhuǎn)染濃度分別為80 nmol/L及50 nmol/L。用qRT-PCR分別檢測(cè)過表達(dá)miR-155（轉(zhuǎn)染miR-155 mimics）與抑制miR-155表達(dá)（轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitors）后空白對(duì)照組、miR-155 mimics組、mimics陰性對(duì)照組、miR-155 inhibitors組、inhibitors 陰性對(duì)照組的miR-155水平變化情況，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測(cè)蛋白表達(dá)：為研究miR-155對(duì)mTOR及ERK1/2通路的影響，我們使用Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-155后對(duì)基礎(chǔ)及AngⅡ作用后的mTOR及ERK1/2的表達(dá)情況。此外，為了驗(yàn)證miR-155是否通過影響mTOR及ERK1/2通路抑制AngⅡ促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)換作用，我們使用Western blot檢測(cè)過表達(dá)及抑制表達(dá)miR-155后空白對(duì)照組、AngⅡ組、miR-155 mimics組、AngⅡ+miR-155 mimics組、miR-155 inhibitors組、AngⅡ+miR-155 inhibitors組3個(gè)表型蛋白標(biāo)志物變化情況。為了觀察miR-155對(duì)AngⅡ促進(jìn)VSMCS表型轉(zhuǎn)換的影響，分為空白對(duì)照、AngⅡ組、miR-155 mimics組、AngⅡ +miR-155 mimics組、AngⅡ+ U0126組、AngⅡ+雷帕霉組。將各處理組細(xì)胞培養(yǎng)基吸出，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）洗2次，加入適量胰酶，補(bǔ)充少量培養(yǎng)基終止反應(yīng)，反復(fù)吹打使細(xì)胞脫落，轉(zhuǎn)移至滅菌1.5 ml離心管，室溫1 500 g離心3 min；棄去上清，預(yù)冷PBS洗沉淀1次，室溫1 500 g離心3 min；棄去上清，加入適量RIPA裂解液，冰浴30分鐘；4℃，9 000 g離心5 min；取上清，用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度[10]。于10% SDS-PAGE 行細(xì)胞蛋白電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)與聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用含5%的脫脂奶粉PBST緩沖液（PBS+TWeen20）室溫封閉過夜，一抗孵育：將一抗以1：500-1:1 000稀釋，4℃孵育過夜；第二天將二抗以1：5 000稀釋，室溫孵育1 h，漂洗，配制ECL顯色試劑配制，將膜放于Bio-Rad的化學(xué)發(fā)光儀器中，滴加適量的ECL發(fā)光液后，進(jìn)行曝光。最后采用Bio-Rad Quantity One軟件定量分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采取Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代VSMC的鑒定（圖1）

倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的大鼠 VSMC，細(xì)胞呈貼壁生長，形態(tài)多為長梭形，細(xì)胞質(zhì)豐富，單層或多層平行排列生長，并呈現(xiàn)典型的峰-谷生長，熒光顯微鏡下α-SM-actin染色顯示胞質(zhì)染色紅色，為陽性染色。

圖1 小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)觀察及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白疫組化鑒定

2.2 AngⅡ影響VSMC內(nèi)miR-155的表達(dá)（圖2）

為研究AngⅡ是否影響VSMC內(nèi)miR-155的表達(dá)，我們將不同濃度（0、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）AngⅡ作用于 VSMC 48 h,并將1×10-6mol/L的 AngⅡ作用于VSMC不同時(shí)間（0、6、12、24、48 h）后，采用qRT-PCR檢測(cè)miR-155表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示,與作用0 h或0 mol/L AngⅡ相比，AngⅡ作用于VSMC后，呈濃度、時(shí)間依賴方式降低miR-155表達(dá)水平。

圖2 血管緊張素Ⅱ?qū)ρ芷交〖?xì)胞miR-155表達(dá)水平的影響

2.3 miR-155轉(zhuǎn)染表達(dá)檢測(cè)（圖3）

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染miR-155 mimics后顯著增加miR-155表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitors后則顯著降低miR-155表達(dá)水平。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)不同處理組中小鼠VSMC的miR-155表達(dá)水平

2.4 miR-155抑制雷帕霉素靶蛋白及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2通路（圖4）

圖4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)不同處理組中血管平滑肌細(xì)胞P-mTOR、mTOR、P-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組相比，1×10-6mol/L AngⅡ作用于VSMC 48 h后可顯著增加mTOR及ERK1/2磷酸化水平，激活mTOR及ERK1/2通路，而轉(zhuǎn)染miR-155 mimics后顯著減少基礎(chǔ)mTOR及ERK1/2磷酸化水平并可減弱AngⅡ促進(jìn)mTOR及ERK1/2通路的激活作用，與之相對(duì)應(yīng)的是，轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitors后則可顯著增加基礎(chǔ)mTOR及ERK1/2磷酸化水平并進(jìn)一步增強(qiáng)AngⅡ促進(jìn)mTOR及ERK1/2通路的激活作用。

2.5 miR-155 mimics,雷帕霉素及U0126均抑制AngⅡ促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)換作用（圖5）

與空白對(duì)照組相比，1×10-6mol/L AngⅡ作用于VSMC 48 h后可促進(jìn)細(xì)胞處于去分化狀態(tài)，顯著減少收縮表型蛋白標(biāo)志物SM22α和α-SM-actin蛋白的表達(dá)，而增加合成表型蛋白標(biāo)志物骨橋蛋白（OPN）的表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-155 mimics可增加基礎(chǔ)SM22α和α-SM-actin蛋白的表達(dá)水平，減少基礎(chǔ)OPN蛋白表達(dá)水平，并可減弱AngⅡ削減SM22α和α-SM-actin蛋白及增加OPN蛋白表達(dá)的作用。1×10-6mol/L AngⅡ分別聯(lián)合應(yīng)用mTOR通路抑制劑Rapamycin（10 ng/ml）及ERK1/2通路抑制劑U0126（10 μM）后均可顯著抑制AngⅡ這種促血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用。

圖5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)不同處理組血管平滑肌細(xì)胞中SM22α、α-SM-actin、OPN的表達(dá)

3 討論

目前已有多項(xiàng)研究顯示有多種miRNA參與VSMC的表型調(diào)控[11-13]。AngⅡ作為一種常見的體內(nèi)刺激因子，可調(diào)節(jié)VSMC表型從安靜的分化狀態(tài)轉(zhuǎn)換為易于發(fā)生增殖、遷移、分泌的去分化狀態(tài)，參與各種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[14]。本研究試圖尋找一種關(guān)于AngⅡ促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)換的新機(jī)制。通過不同濃度、時(shí)間的AngⅡ作用于VSMC，觀察miR-155表達(dá)的變化，結(jié)果顯示AngⅡ以濃度、時(shí)間依賴方式抑制miR-155的表達(dá)，這提示我們miR-155可能作為AngⅡ促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)換的中間橋梁發(fā)揮其作用。AngⅡ可激活PI3K/AKT與MAPK通路參與細(xì)胞表型的調(diào)控[15,16]，而新近研究證實(shí)miR-155可通過作用不同靶基因調(diào)控這兩條通路[6,9]，所以我們推測(cè)miR-155可能參與到AngⅡ促VSMCs表型轉(zhuǎn)換過程。

本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-155后可顯著抑制基礎(chǔ)水平及AngⅡ促進(jìn)mTOR與ERK1/2蛋白的活化，而抑制miR-155表達(dá)則可進(jìn)一步促進(jìn)mTOR及ERK1/2蛋白的活化，證實(shí)miR-155可抑制PI3K/AKT/mTOR與MAPK/ERK1/2通路的激活。Western blot結(jié)果顯示AngⅡ可顯著抑制收縮表型蛋白標(biāo)志物SM22α和α-SM-actin的表達(dá)，促進(jìn)合成表型蛋白標(biāo)志物OPN的表達(dá)，使用mTOR通路抑制劑雷帕霉素及ERK1/2通路抑制劑U0126可顯著抑制AngⅡ促VSMC表型轉(zhuǎn)換的作用。與使用雷帕霉素及U0126的結(jié)果相一致，轉(zhuǎn)染miR-155 mimics也可取得這種抑制AngⅡ促VSMCs表型轉(zhuǎn)換的效果，證實(shí)miR-155可通過抑制PI3K/AKT與MAPK的激活參與AngⅡ促VSMC表型轉(zhuǎn)換的調(diào)控。這與之前的報(bào)道不盡一致，如在B細(xì)胞淋巴瘤中miR-155可通過下調(diào) PIK3R1，一種PI3K/AKT通路的負(fù)調(diào)控因子，從而激活PI3K/AKT通路促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[6]。這種現(xiàn)象可能跟不同的細(xì)胞、不同的刺激物下miR-155作用于不同靶基因直接或間接發(fā)揮相應(yīng)作用有關(guān)，本研究miR-155具體通過調(diào)控哪些靶基因發(fā)揮其調(diào)控細(xì)胞表型作用還有待下一步研究證實(shí)，這也提示我們miRNA轉(zhuǎn)化體內(nèi)研究的復(fù)雜性。

總之，本研究證實(shí)了AngII通過抑制miR-155表達(dá)促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)換，AngⅡ可以濃度、時(shí)間依賴方式降低miR-155表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)染miR-155 mimics后可抑制AngⅡ作為mTOR與ERK1/2激活劑所起到的促VSMC去分化作用，從而減少AngⅡ?qū)SMC的促增殖、遷移及分泌作用，為心血管疾病提供新的治療方向。

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Effect of miR-155 on AngII-induced Mice Vascular Smooth Muscle Cell Phenotype Switching With its Mechanism

ZHANG Zi-wei, YANG Li-xia, LV Jin-lin, WANG Xian-mei, YANG Zhi-hua, LU Ni-hong.
Department of Cardiology, Kunming General Hospital of Chengdu Military Area, Kunming (650032), Yunnan, China
Corresponding Author: YANG Li-xia, Email: doctorlxyang@126.com

Objective: To observe the effect of miR-155 on angiotensin II (AngII)-induced mice vascular smooth muscle cell(VSMC) phenotype switching with its possible mechanism.

Methods: Primary cultured mice VSMCs were treated by AngII at different concentrations and time periods, relevant expressions of miR-155 were examined by RT-PCR. qRT-PCR was conducted to determine miR-155 changes in Blank control group, miR-155 mimics group, miR-155 mimics negative control (NC) group, miR-155 inhibitor group and miR-155 inhibitor NC group. Western blot analysis was performed to measure the effect of miR-155 on AngII-enforced ERK1/2 and mTOR signaling pathway in Blank control group, AngII group, miR-155 mimics group, AngII+miR-155 mimics group, miR-155 inhibitor group and AngII+miR-155 inhibitor group; to detect the impact of miR-155, rapamycin (Rap) and U0126 onAngII promoted VSMC phenotype switching in Blank control group, AngII group, miR-155 mimics group, AngII+miR-155 mimics group, AngII+U0126 group and AngII+Rap group, and to detect protein expressions of SM22α, α-SM-actin (contractile phenotype marker protein) and OPN (synthetic phenotype marker).

Results: AngII decreasing miR-155 expression was in a dose- and time-dependent manner. miR-155 could reduce the basal and AngII-promoted ERK1/2, mTOR signaling pathway, while miR-155 inhibitor could elevate the above effect. Rap,U0126 and miR-155 could inhibit AngII-attenuated expressions of SM22α, α-SM-actin and meanwhile inhibit AngII-enforced expression of OPN.

Conclusion: miR-155 could inhibit mice AngII-promoted VSMC phenotype switching which might be via inhibiting the activations of mTOR and ERK1/2.

RNA; Angiotensin II; Muscle cells, smooth muscle

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81170250）

650032 云南省昆明市，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院 心內(nèi)科（張紫微、楊麗霞、王先梅、楊智華）；昆明醫(yī)科大學(xué)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院（呂晉琳、陸霓虹）

張紫微 主治醫(yī)師 博士研究生 主要從事心血管病醫(yī)學(xué)研究 Email: zzwkunming@126.com 通訊作者：楊麗霞 Email:doctorlxyang@126.com

R54

A

1000-3614（2017）10-1019-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.10.019

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1019.)

2016-08-27）

（編輯：許菁）