不同血氧飽和度影響主肺動脈壓力變化的離體血管模型研究

溫彬，劉垚，孟健，李勇男，唐躍，潘湘斌

不同血氧飽和度影響主肺動脈壓力變化的離體血管模型研究

溫彬，劉垚，孟健，李勇男，唐躍，潘湘斌

目的：建立不同血氧飽和度影響主肺動脈壓力變化的離體模型，為進一步探索肺動脈高壓機制提供研究平臺。

方法：取新西蘭大耳白兔20只，隨機選取5只作為正常對照組。其余15只分離肺動脈后將血管置于培養液中，并接入體外循環系統；以新鮮肝素化兔血灌流培養48 h，灌注壓力維持40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；期間通過調節膜肺給氧量控制血氧飽和度，建立3個模型組（n=5）：高飽和度組（90%～100%）、中飽和度組（65%～75%）、低飽和度組(40%～50%)。轉流結束后獲取離體血管和正常對照組兔肺血管行病理形態分析、肺動脈組織IPP6.0定量分析以及勻漿一氧化氮含量分析比較。

結果：3個模型組轉機時間均達到48 h，壓力穩定控制在40 mmHg，血氧飽和度由高到低分別為（97.94±1.01）%、（72.14±12.85）%、（43.83±8.71）% （P＜0.05）。病理分析結果顯示：與正常對照組兔肺動脈相比，3個模型組離體培養的肺動脈管壁均明顯增厚；隨著血氧飽和度降低，3個模型組離體培養的肺動脈彈力纖維逐漸增多、增粗,差異均有統計學意義（P＜0.05）。

結論：本實驗建立了不同血氧飽和度影響主肺動脈壓力變化的離體血管模型。

高血壓，肺性；模型，心血管；血氧飽和度

完全型大動脈轉位（transposition of great arteries，TGA）是一種左右心室和主動脈、肺動脈位置異常的疾病。我們在臨床工作中發現，合并室間隔缺損（vascular septal defect，VSD）的大動脈轉位（TGA）所致的肺動脈高壓比單純VSD導致的肺動脈高壓具有更好的手術適應證[1]。進一步活檢發現，在相同的肺動脈壓力下，TGA患者肺血管重構程度較輕[2]，可能與TGA患者肺動脈連接于解剖左心室、肺動脈內血氧飽和度異常增高有關。

上述發現為研究肺動脈高壓提供了新的方向，但是，難以在人體上進一步探索發生機制，急需構建動物模型提供研究平臺。由于TGA患者心臟結構改變巨大，影響肺動脈高壓進展的因素極為復雜，目前少有動物模型能夠模擬。為了模擬不同血氧飽和度所產生的差異性，我們建立了一種新型離體血管模型，在恒定壓力下體外培養主肺動脈，同時通過膜肺給氧調控血氧飽和度，以研究不同血氧飽和度對高壓環境下肺動脈重構的影響。

1 材料與方法

實驗動物與分組：本實驗經由中國醫學科學院阜外醫院實驗動物福利與倫理審查委員會批準，動物實驗由心血管植入材料臨床前研究評價北京市重點實驗室完成（依托單位中國醫學科學院阜外醫院動物實驗中心）。選取成年健康雄性新西蘭大耳白兔20只，清潔級，體重2.5 kg左右(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，隨機選取5只作為未灌注培養的正常對照組，其余15只依據離體血管培養時的血氧飽和度隨機分為3個模型組（n=5）：高飽和度組(90%～100%)、中飽和度組(65%～75%)、低飽和度組 (40%～50%)。

離體血管制備：稱重，經兔耳緣靜脈分別注射1%肝素鈉溶液(200 U/kg)，3%戊巴比妥鈉溶液（1 ml/kg）。麻醉滿意后仰臥固定，胸腹部備皮，消毒，剪開腹壁，暴露下腔靜脈。16G套管針穿刺下腔靜脈，50 ml無菌注射器采血，注入一次性使用塑料血袋（四川南格爾生物科技有限公司）中待用。取血后，向上延長腹部切口，解剖暴露胸腔，迅速聯合摘取心肺并置于無菌培養皿中，在此過程中注意不損傷肺動脈。無菌培養皿放入冰盒內，精細分離主肺動脈及左右肺動脈，剪去纖維結締組織和肺組織。分別經右心室和肺血管分支遠端插入一次性動脈插管，插管不宜深入，以免損傷血管內皮，3-0絲線綁扎連接處。弱勢血管分支端留置22G套管針并連接powerlab生理記錄儀，用于循環壓力監測。各分支置管完畢后剪去心臟和其余肺組織。

循環回路構建：離體血管循環系統（圖1）包括動物體外循環配套回流室及管路（東莞科威醫療用品公司）、滾壓泵（德國Stockert）、特制動物膜肺（東莞科威醫療用品公司）、光學血氧飽和度監測接頭（美敦力Biotrend氧飽和度儀）?；亓魇揖嚯x體血管高度約為30 cm，維持壓力恒定。滾壓泵轉速均勻，提供平穩血流。膜肺進氣口連接空氧混合器并接入中心供氣系統，提供穩定濃度和流量的氧氣。離體血管置于DMEM高糖培養液中（包含100 IU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、10 μg/L的兩性霉素B、5%的胎牛血清），并置于二氧化碳恒溫培養箱（美國Thermo Fisher Scientific）中，設定溫度37℃，二氧化碳濃度為5%。

圖1 離體血管循環模式圖

轉流過程：管道連接完畢，1%肝素鈉溶液預充排氣。接入離體血管，設定灌注壓力40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），經回流室逐步換入新鮮肝素化兔血。如圖1所示，滾壓泵將血液從回流室泵出，流經血栓過濾器、膜肺、血氧飽和度監測點、離體血管后回流至回流室。根據光學血氧飽和度儀顯示數值間斷開閉空氧混合器給氧，維持血氧飽和度恒定。每6 h更換全血，每24 h更換培養液。

實驗數據采集：轉機開始后，每小時于離體血管前三通閥處抽取1 ml血液做血氣分析（雅培iStat-300便攜式血氣分析儀），記錄整個轉流過程中各時間點血氧飽和度值。

標本采集：持續灌注48 h后，取下離體血管，以4℃磷酸緩沖鹽溶液反復沖洗。洗凈后，部分管壁組織浸泡于10%中性福爾馬林中，固定24 h備用。對固定好的血管組織常規進行蠟塊包埋，切片，采用彈力纖維、肌纖維、膠原纖維三色染色，用于評價肺血管重構病變。另取剩余標本勻漿處理后檢測一氧化氮含量，檢測過程嚴格按照總一氧化氮檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）說明書進行。

統計學方法：應用統計軟件SPSS24.0進行處理和數據分析，對轉流過程中不同組別的血氧結果采用單因素方差分析，數據用均數±標準差（±s）表示，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

3個模型組離體血管轉機結果：3組離體血管轉機時間均達到48 h，轉機過程中無破裂，無漏血滲血，剪開管壁未見附壁血栓形成。

3個模型組血氧飽和度和血氧分壓結果（表1）：3組血氧飽和度和血氧分壓數值之間的差異均有統計學意義（P均＜0.05）。血氧飽和度結果符合實驗設計，該模型可以建立循環系統內血氧飽和度梯度。

表1 3個模型組血氧飽和度和血氧分壓結果（n=5，±s）

表1 3個模型組血氧飽和度和血氧分壓結果（n=5，±s）

注：與高飽和度組比較*P＜0.05，與中飽和度組比較△P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

項目 高飽和度組 中飽和度組 低飽和度組血氧飽和度 (%) 97.94±1.01△ 72.14±12.85* 43.83±8.71*△血氧分壓 (mmHg) 174.15±28.65△ 42.15±14.35* 20.85±10.13*△

正常對照組兔肺動脈和3個模型組離體培養肺動脈的病理形態分析（圖2、表2）：肉眼觀察：相比于正常對照組兔肺動脈，3個模型組離體培養肺動脈均出現管壁增厚，管壁通透度下降。鏡下觀察（圖2）顯示：3個模型組離體培養肺動脈組織以中膜增厚為主。采用自動圖像分析軟件(Image Pro Plus6.0)進行定量分析顯示（表2）：隨著血氧飽和度降低，3個模型組離體培養肺動脈中膜層彈力纖維（黑色）增多、變粗、變長，分布密集；相比于正常對照組兔肺動脈，3個模型組離體培養肺動脈肌纖維（黃色）、膠原纖維（粉紅色）均明顯增加（P均＜0.05）。

圖2 正常對照組兔肺動脈和3個模型組離體培養肺動脈組織病理染色結果(n=5，×20)

表2 正常對照組兔肺動脈和3個模型組離體培養肺動脈組織IPP6.0定量分析結果(n=5,±s）

表2 正常對照組兔肺動脈和3個模型組離體培養肺動脈組織IPP6.0定量分析結果(n=5,±s）

注：與高飽和度組比較*P＜0.05，與中飽和度組比較△P＜0.05，與低飽和度組比較▲P＜0.05

分組 管壁厚度 (μm) 彈力纖維 (pixel) 肌纖維 (pixel) 膠原纖維 (pixel)正常對照組 233.50±12.96*△▲ 8 697.3±467.3*△▲ 8 149.3±419.6*△▲ 6 661.7±676.5*△▲高飽和度組 390.02±7.25△▲ 10 600.3±348.2△▲ 9 701.0±214.4△▲ 14 661±855.4△▲中飽和度組 450.35±19.13*▲ 31 531.3±1 465.0*▲ 10 462.3±359.4*▲ 17 252.7±765.2*▲低飽和度組 548.17±6.16*△ 66 115.7±5 713.0*△ 14 139.0±598.8*△ 21 874.3±1 296.3*△

3個模型組離體培養肺動脈組織勻漿一氧化氮含量分析結果（圖3）：隨著血氧飽和度水平降低，高飽和度組、中飽和度組、低飽和度組肺動脈組織勻漿一氧化氮含量逐漸升高，組間差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

圖3 3個模型組離體培養肺動脈組織勻漿一氧化氮含量比較（n=5）

3 討論

雖然多年來對缺氧或高氧導致的肺動脈高壓進行了大量研究，但是血氧飽和度對肺動脈高壓的影響與缺氧或高氧對肺動脈高壓的影響并不相同。因為即使吸入純氧，正常肺動脈內的血氧飽和度仍會基本維持在76%的正常水平，不會像TGA那樣能增高到接近100%[2]。正常情況下，肺循環和體循環是串聯的，而TGA將兩個循環變為并聯：肺循環的氧合血進行重復循環，可以維持血氧飽和度接近100%；體循環的非氧合血引起組織缺氧，使左右心室負荷加重。合并有VSD或者動脈導管未閉的TGA患者因生后肺動脈壓下降，形成體-肺循環分流，肺循環血量逐漸增多，逐漸形成肺動脈高壓[3]，其病理表現為：肺血管壁明顯增厚，尤其以中膜增厚最為明顯，彈力纖維增多增粗[4,5]。隨著肺血管重構加重，一氧化氮水平升高，可能是離體血管的急性代償反應[6,7]：飽和度降低導致肺血管重構趨于明顯，同時缺氧導致一氧化氮合酶分泌增多[8]，管壁代償性分泌一氧化氮以減輕肺動脈高壓形成。

本研究通過構建離體模型模擬類似的病理生理改變，模型由體外組織培養和體外循環灌注兩部分構成。組織培養技術至今已成為生物、醫學研究中廣泛采用的技術方法。將離體組織放入配置好的培養液中，并置于二氧化碳恒溫箱內模擬生物體內生長環境，可以維持細胞活性。Lehoux等[9]將離體頸動脈置于DMEM高糖培養液中并給予不同壓力灌注，研究了高血壓發生機制。另一方面，體外循環技術是心臟外科領域非常成熟的技術。滾壓泵可以維持平穩血流和保持壓力恒定，膜肺用于氧合血液，同時排除二氧化碳，維持循環內氧飽和度穩定。

本研究通過調節回流室距離離體血管的高度[10]和滾壓泵轉速兩方面維持壓力恒定，調節肺血管內壓力為40 mmHg。正常兔肺動脈平均壓為（11.2±3.2）mmHg，體-肺分流高壓模型肺動脈壓為（19.2±3.7）mmHg（P＜0.05）[11]，大于此模型壓力可形成肺動脈高壓表現，但是壓力過高又會增加滲漏風險，無法達到預期灌注時間。本研究多次平衡灌注壓力與灌注時間的關系，將壓力設定為40 mmHg，屬于高壓灌注，也可形成類似肺動脈高壓的病理表現。

調節血氧飽和度是該模型的關鍵點及難點，我們在實施本研究前，通過預實驗進行了大量的摸索工作，發現調高給氧濃度雖可使血氧飽和度增加，但并不能維持穩定：恒定給氧流量50 ml/min和氧濃度60%通氣，血氧飽和度升高至100%，穩定一段時間后（平臺期），開始緩慢下降；即使維持流量不變，抬高給氧濃度到100%，血氧飽和度也無法維持在100%，表現為持續更長平臺期后逐漸下降；完全關閉給氧，氧飽和度則無上升階段，逐漸緩慢下降。血氧飽和度降低可能與血細胞自身代謝產生酸性產物積累相關，故需要通過間斷開放氣體以排除循環內產生的二氧化碳，才可使氧飽和度上升。

本實驗成功建立了不同血氧飽和度影響主肺動脈高壓發展的離體血管模型，該模型簡便、穩定、可靠。該方法可為進一步探索不同血氧飽和度對高壓環境下肺動脈重構的影響機制提供基本模型。

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An in vitro Vascular Model for Studying the Impact of Different Blood Oxygen Saturation on Main Pulmonary Artery Pressure Changes

WEN Bin, LIU Yao, MENG Jian, LI Yong-nan, TANG Yue, PAN Xiang-bin.
Department of Cardiac Surgery,National Center for Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing(100037), China
Corresponding Author: PAN Xiang-bin, Email: xiangbin428@hotmail.com

Objective: To establish anin vitrovascular model to study the impact of different blood oxygen (O2) saturation on main pulmonary artery pressure changes in order to further explore the mechanism of pulmonary hypertension.

Methods: 20 New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups: Normal control group and 3 experimental groups as High O2(90%-100%)saturation group, Middle O2(65%-75%)saturation group and Low O2(40%-50%) saturation group,n=5 in each group. Thein vitropulmonary artery segments were treated with fresh heparinized rabbit blood and connected to extracorporeal circulation system for 48h at perfusion pressure at 40 mmHg; the condition of O2saturation was regulated by membrane oxygenator. Pathological morphology was compared among different groups.

Results:The bypass time in all 3 groups was 48h and the pressure was stably controlled at 40 mmHg. Blood O2contents in High O2saturation group, Middle O2saturation group and Low O2saturation group were (97.94±1.01) %, (72.14±12.85) %and (43.83±8.71) % respectively,P＜0.05. Pathological analysis indicated that compared with Normal control group, 3 experimental groups had increased thickness in pulmonary artery wall; upon O2saturation decreasing, the elastic fibers in pulmonary artery became increasing and more thickening accordingly.

Conclusion: We established anin vitrovascular model to study the impact of different blood O2saturation on main pulmonary artery pressure changes in experimental rabbits.

Hypertension, pulmonary; Model, cardiovascular; Oxygen saturation

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1024.)

國家自然科學基金（81400041）；高等學校博士學科點專項科研基金（20131106120006）

100037 北京市，北京協和醫學院 中國醫學科學院 國家心血管病中心 阜外醫院 心外科

溫彬 碩士研究生 主要研究方向：先天性心臟病所致肺動脈高壓機制研究 Email：wenbin96723@163.com 通訊作者：潘湘斌Email: xiangbin428@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2017）10-1024-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.10.020

2017-06-08）

（編輯：朱柳媛）