食管癌患者miR-182表達水平及其對預后的影響

魯之中 ，李軍民 ，胡云芝 ，李曉輝 ，李衛 ，姜富國 ，李帥 ，申辰

（河南省焦作市人民醫院 1.檢驗科，2.兒科，3.腫瘤外科，河南 焦作 454002）

食管癌患者miR-182表達水平及其對預后的影響

魯之中1，李軍民1，胡云芝2，李曉輝3，李衛1，姜富國1，李帥1，申辰1

（河南省焦作市人民醫院 1.檢驗科，2.兒科，3.腫瘤外科，河南 焦作 454002）

目的探討miR-182在食管癌患者組織中的基因表達及其對預后的影響。方法采用實時熒光定量PCR檢測59例食管癌標本和癌旁組織中miR-182表達水平；并分析其表達水平與患者的臨床病理特征和隨訪結局之間的關系。結果相較于癌旁組織，食管癌組織中miR-182表達水平增高（P＜0.05）；miR-182表達水平與腫瘤分化程度、浸潤深度、是否發生轉移以及臨床分期相關（P＜0.05），與性別、年齡以及腫瘤大小無關系（P＞0.05）；生存分析顯示miR-182高表達組總體生存期低于低表達組（P＜0.05）；Cox多因素回歸分析結果顯示miR-182表達水平可作為食管癌患者預后不良的標志之一。結論miR-182在食管癌組織中高表達，其高表達提示預后較差，可作為食管癌潛在的預測分子標志物。

miR-182；食管癌；預后；實時熒光定量PCR

食管癌在我國屬于臨床常見惡性腫瘤之一，病死率高，危害較大，其病理類型＞90%為鱗癌。雖然根治性食管癌切除術+化療的治療方案已經普及，但其5年總體生存率仍較低[1]。到目前為止，雖然分子生物學研究已發現食管癌發生過程中大量異常出現的分子事件，但是針對食管癌高危人群篩選、早期診斷以及預后判斷的有效分子標志物仍很有限。因此，更深入的研究和篩選食管癌早期診斷和預后判斷分子標志物具有重要臨床意義。

MicroRNAs是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，主要通過與靶mRNA結合抑制其蛋白表達從而實現其生物學功能[2]。研究發現，miRNAs在多種腫瘤，包括食管癌的發生、發展過程中發揮重要作用，因此其異常表達可能作為食管癌潛在的診斷和預后判斷的標志物。

近期研究發現，MicroRNA 182（miR-182）在多種腫瘤中異常表達，并且其異常表達跟患者預后相關。JIAN等[3]發現食管癌細胞系KYSE410中miR-182上調，且食管癌患者血清中miR-182同樣高于正常對照，但食管癌組織中miR-182表達情況以及異常表達的miR-182跟食管癌患者預后是否相關尚不明確。本研究主要通過實時熒光定量PCR檢測miR-182在食管癌標本中的表達水平，并結合臨床病理及隨訪資料，探討miR-182在食管癌預后判斷中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標本來源 選取2011年2月-2013年2月本院手術切除并且常規HE染色確定為食管鱗癌患者的食管癌組織和相應癌旁正常組織，所有標本均液氮凍存并存儲于-80℃冰箱中，后續用于提RNA。所有患者術前均未接受化療并且均簽署知情同意書。食管癌病理分型及分期標準按照國際抗癌聯盟（international union against cancer，UICC）食管癌分期標準執行。本研究經焦作市人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.1.2 患者資料 食管癌患者總共59例。其中，男性38例，女性21例；年齡44～79歲，中位年齡61歲；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期36例，Ⅲ、Ⅳ期23例；中、高分化29例，低、未分化30例。

1.1.3 主要試劑及儀器 高速冷凍離心機（購自德國eppendorf公司）、nanodrop紫外分光光度計（購自美國nanoDrop公司）、PCR反應儀（美國Bio Raid公司）、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（購自美國ABI公司）、miRcute miRNA isolation kit（購自北京天根公司）、miRNA逆轉錄及熒光定量試劑盒（購自日本TaKaRa公司）、has-miR-182及內參RNU6B引物（購自美國金維智公司）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 根據天根miRcute miRNA isolation kit試劑盒操作步驟，取0.1 g組織液氮保護下研磨，加入1 ml裂解液，加入氯仿抽提，并用過柱法分別提取腫瘤組織和癌旁組織總RNA。用紫外分光光度計測量RNA濃度及吸光度，要求A260/A280＞1.8。取1μl RNA溶液在1.5%的變性瓊脂糖凝膠中進行電泳，測定RNA的完整性。

1.2.2 加尾法逆轉錄 取1μg總RNA使用Prime-Script miRNA cDNA合成試劑盒進行cDNA的合成，反應體系為20μl，具體操作步驟見使用說明書。

1.2.3 miR-182表達水平檢測 用以上步驟獲得的cDNA進行適當稀釋，參照SYBR Premix Ex Taq kit試劑盒說明書進行操作。反應具體過程為：50℃激活聚合酶2 min，95℃預變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s，擴增40個循環；結束后制作溶解曲線。采用管家基因U6作為內參對照。

1.2.4 qRT-PCR結果分析 結果采用2-ΔΔCt法進行處理，首先獲取miR-182和內參U6的Ct值，然后計算ΔCt=Ct（miR-182）-Ct（U6），再計算ΔΔCt=ΔCt腫瘤組織-ΔCt癌旁組織，進一步計算 miR-182在食管癌組織和癌旁組織中的表達倍數的差異。

1.3 隨訪

所有食管癌術后患者均進行電話隨訪，了解術后并發癥、復發以及生存情況等信息，隨訪截止日期為2016年5月，中位隨訪時間為29個月（5～42個月）。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組間miRNA-182表達倍數的均值差異采用配對樣本t檢驗分析；miRNA-182與臨床病理特征的關系用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法進行生存分析，并繪制生存曲線；采用Cox回歸模型進行多因素分析，其中α入=0.05，α出=0.10；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-182在食管癌組織和癌旁組織中的表達

結果顯示，食管癌腫瘤組織中miR-182表達水平（10.89±3.95）高于癌旁組織（6.34±2.91，P=0.000）。見圖 1。

2.2 miR-182的表達水平與食管癌患者臨床病理特征之間的關系

根據miR-182的表達情況，將食管癌患者分為miR-182高表達（n=30）和低表達組（n=29）。食管癌組織中miR-182的表達水平與患者臨床病理特征間的關系見表1。miR-182的高表達跟食管癌患者腫瘤分化程度（P=0.042）、T分期（P=0.007）、淋巴結轉移情況（P=0.001）以及臨床分期相關（P=0.001）；而跟患者性別（P=0.336）、年齡（P=0.436）以及腫瘤大小無關（P=0.110）。見表1。

圖1 miR-182在食管癌組織和癌旁組織中的相對表達量（n=59）

圖2 不同miR-182表達水平食管癌患者的生存分析

2.3 miR-182表達水平與食管癌患者預后的關系

miR-182高表達組中位生存時間（平均28.9個月）低于miR-182低表達組（36.1個月），差異有統計學意義（P=0.015）（見圖 2）。此外，Cox比例風險模型多因素分析結果顯示，T分期（P=0.060），臨床分期（P=0.687）以及分化程度（P=0.140）跟食管癌患者預后無關；淋巴結轉移（P=0.027）以及miR-182表達水平（P=0.032）是食管癌患者預后的獨立危險因素。見表2。

表1 食管癌組織中miR-182表達水平與患者臨床病理參數之間的關系

表2 食管癌患者總生存期Cox多因素回歸分析相關參數

3 討論

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，病死率較高，且預后較差。目前很多臨床病理學特征可作為食管癌患者預后的重要提示，但是其不能準確且個體化預測患者預后情況[4]。因此，研究食管癌發生、發展過程中關鍵分子生物學事件，尋找能早期診斷、靶向治療以及預后預測的重要分子標記物具有重要臨床意義。

現已在哺乳動物中發現超過1 900條miRNAs，該miRNAs可調控超過60%基因功能[2]。在腫瘤研究中已證實異常表達的miRNAs可發揮促癌或者抑癌的作用；且該異常表達的miRNAs也可作為潛在的診斷和預后判斷的標志物[5]。近年來，食管癌中的研究發現越來越多異常表達的miRNAs；其中miR-21[6]、miR-192[7]和miR-106b等[8]上調，可促進腫瘤細胞增殖和侵襲轉移；miR-375[9]、miR-203 等[10]下調，可抑制腫瘤細胞周期并且促進其凋亡。此外，miR-21[11]和miR-375[12]在食管癌預后判斷中的研究也已經被證實。本研究主要就miR-182在食管癌中的表達以及其臨床意義就行探討。

本研究結果顯示，相較于癌旁組織，miR-182在食管癌組織中表達上調。JIANG等[3]發現，食管癌細胞系KYSE410中miR-182上調，并且食管癌患者血清中miR-182同樣高于正常對照。以上結果提示miR-182在食管癌中具有癌基因的傾向。但是，目前研究發現，miR-182在不同腫瘤中發揮不同的作用。在宮頸癌[13]、乳腺癌[14]以及肝癌[15]中，miR-182 可促進腫瘤進展；但是在胃腺癌[16]和肺癌[17]中，miR-182可抑制腫瘤的進展。由于miRNA的作用機制是通過和目的mRNA結合抑制其功能，其產生的總體生物學效應依賴于其調控的不同基因之和，因此，同一miRNA在不同腫瘤中能發揮不同的生物學效應。此外，檢測手段的差異以及腫瘤患者的異質性也是miRNA不同生物學效應產生原因。

此外，筆者發現miR-182的高表達跟食管癌分化程度、浸潤深度、是否淋巴結轉移以及臨床分期密切相關，生存分析結果顯示高表達miR-182患者預后較低表達患者差，且單因素和多因素回歸分析結果也證實miR-182的表達水平跟食管癌患者預后相關，以上結果提示miR-182在腫瘤的侵襲轉移相關，且具有一定的病情評估和預后判斷作用。JANG等[18]發現miR-182在黑色素瘤腫瘤組織表達上調，且其表達水平跟病理分級以及預后密切相關。LIU等[19]發現結腸癌中高表達的miR-182跟腫瘤大小和腫瘤轉移密切相關，并可以作為預后判斷的有效指標。

本研究主要從臨床角度去研究miR-182異常高表達與食管癌臨床特征的相關性，未進一步從分子角度探討其促進食管癌發生、發展的機制。在多種腫瘤中，miR-182的促癌機制均有過報道。miR-182在成神經管細胞瘤中可通過活化PI3K/Akt/mTOR通路促進腫瘤細胞的增殖[20]。在乳腺癌中，miR-182可抑制多種抑癌基因的表達，如BRCA1、FOXO1和FOXO3等[21-23]。而在葡萄膜黑色素瘤細胞中，miR-182主要通過靶向調節MITF、BCL2或細胞周期蛋白D2起到抑癌基因的作用[24]。miR-182在食管癌中的研究不多，JIANG等發現miR-182可通過抑制MTSS1促進食管癌細胞的增殖和侵襲轉移[25]。miR-183和miR-182屬于同一家族，可能具有相似的生物學功能，研究也發現miR-183可通過調節食管癌細胞中PDCD4抑制其凋亡[26]。

綜上所述，miR-182在食管癌中的表達水平具有重要的臨床意義，其在腫瘤的發展過程中可能發揮癌基因的作用，并且可以作為一個潛在的獨立預測預后的因素。

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Expression of miRNA-182 and its effect on prognosis of esophageal carcinoma

Zhi-zhong Lu1,Jun-min Li1,Yun-zhi Hu2,Xiao-hui Li3,Wei Li1,Fu-guo Jiang1,Shuai Li1,Chen Shen1
(1.Department of Laboratory,2.Department of Pediatrics,3.Department of Surgical Oncology,People's Hospital of Jiaozuo,Jiaozuo Henan 454002,China)

ObjectiveTo investigate the concentration of miRNA-182 in esophageal carcinoma and its association with disease prognosis.MethodsMicroRNA-182 in 59 esophageal carcinoma tissues and related adjacent healthy tissues were measured by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCT).Association of miRNA-182 with clinical characters including pathologic types,and clinical outcome was determined.ResultsThe concentration of miRNA-182 in esophageal carcinoma tissues was significantly increased when compared with that in adjacent healthy tissues (P＜0.05).Overexpression of miRNA-182 correlated closely with tumor differentiation level,depth of infiltration,metastasis,and clinical stage(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis indicated that patients with high miRNA-182 experienced worse outcome compared with others(P＜0.05).Moreover,multivariate analysis showed that increase of miRNA-182 was an independent predictor of overall survival(P＜0.05).ConclusionsMicroRNA-182 is overexpressed in esophageal carcinoma tissue and concentration of miRNA-182 is closely correlated with poor outcome,suggesting that miRNA-182 may serve as a prognostic biomarker for esophageal carcinoma.

miRNA-182;esophageal carcinoma;prognosis factor;qRT-PCR

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.008

1005-8982（2017）24-0039-05

2017-03-30

（王榮兵 編輯）