結直腸癌組織中卷曲螺旋結構域12蛋白表達與腫瘤生長侵襲的關系*

耿瑋，葉智斌，范亞男，梁巍，張夢陽

（河北省人民醫(yī)院 普外五科，河北 石家莊 050051）

結直腸癌組織中卷曲螺旋結構域12蛋白表達與腫瘤生長侵襲的關系*

耿瑋，葉智斌，范亞男，梁巍，張夢陽

（河北省人民醫(yī)院 普外五科，河北 石家莊 050051）

目的觀察結直腸癌組織中卷曲螺旋結構域12（CCDC12）蛋白的表達情況，并探討CCDC12蛋白與腫瘤生長侵襲的關系。方法免疫組織化學SP法檢測94例結直腸癌組織及癌旁正常腸黏膜組織中CCDC12蛋白的表達，同時檢測與腫瘤生長侵襲有關的蛋白質Cyclin D1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白表達。記錄患者腫瘤生物學特征，分析CCDC12蛋白與結直腸癌生物學特征及Cyclin D1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白的關系。結果CCDC12、CyclinD1、MMP-9及TIMP-1蛋白在結直腸癌組織中陽性表達率均高于癌旁正常腸黏膜組織（χ2=38.480、30.312、38.368及 7.667，均P＜0.01），P21蛋白在兩種組織中差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.862，P=0.353）。在結直腸癌組織中CCDC12蛋白陽性表達與腫瘤細胞分化、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有關（χ2=5.130、5.902、9.760 及 4.458，P=0.024、0.015、0.002 及 0.035）。Spearman 相關性分析發(fā)現(xiàn)，CCDC12 與CyclinD1、MMP-9蛋白表達呈正相關（r=0.302和0.365，P=0.003和0.001），CCDC12與P21表達呈負相關（r=-0.287，P=0.005）。結論結直腸癌中存在CCDC12蛋白表達增高現(xiàn)象，CCDC12可能通過與CyclinD1、P21及MMP-9蛋白的相互作用參與了結直腸癌的生長及侵襲過程。

結直腸癌；卷曲螺旋結構域12；腫瘤生長；腫瘤侵襲

我國結直腸癌的發(fā)病率占惡性腫瘤第4位，死亡率居第5位[1]，雖然手術及藥物治療結直腸癌已取得了較大的進展[2-3]，但由于結直腸癌發(fā)病隱匿、無特異性癥狀，因此很難早期診斷，患者就診時多已處于進展期。該病的整體治療效果還遠不能令人滿意[4]。結直腸癌生長迅速、具有較強的侵襲轉移能力，這是結直腸癌治療效果不佳的重要原因。結直腸癌的生長及侵襲是多種基因異常表達的結果，探討其機制對結直腸癌的綜合診治意義重大。卷曲螺旋結構域（coiled-coil domain-containing，CCDC）基因家族有多個成員，研究發(fā)現(xiàn)一些CCDC基因與惡性腫瘤關系密切[5-7]，也有研究發(fā)現(xiàn)CCDC12與結直腸癌有關[8]。但有關結直腸癌組織中CCDC12表達及意義的相關報道極少。本研究通過檢測結直腸癌組織中CCDC12蛋白表達情況，為探討CCDC12蛋白與結直腸癌的生長及侵襲的關系提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月-2015年6月于河北省人民醫(yī)院外科手術的94例結直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁正常腸黏膜組織石蠟標本進行檢測。入組標準：①年齡≥18歲；②患者有手術切除標本確診為結直腸癌；③術前未接受過放療、化療及介入治療等措施；④患者為初診。排除標準：①合并其他惡性腫瘤或有其他腫瘤病史的患者；②曾行手術治療的復發(fā)患者；③接受新輔助放化療或靶向治療的患者。男性61例，女性 33例；年齡 37～81歲，平均（53.52±8.95）歲。患者均簽署知情同意文件，本研究得到河北省人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器

CCDC12（購自美國 Aviva公司），CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1抗體（購自美國Sigma公司），免疫組織化學試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（均購自北京中杉生物公司），切片機（RM2255型）、組織細胞染色機（ST5020型）（購自德國LEICA公司）。

1.3 免疫組織化學檢測及結果判斷

將石蠟包埋的組織在切片機上連續(xù)4 μm切片，然后進行脫蠟、水化、抗原修復及阻斷內源性過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，分別加入各一抗，浸泡、沖洗后加入二抗，37℃孵育30 min，最后進行顯色、復染及封片。陰性對照為磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），陽性對照為各一抗提供的陽性對照。CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白均以在細胞漿或細胞膜出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為染色陽性。在鏡下（×400）隨機選取5個視野，應用二次計分法將陽性細胞比例與染色強度的乘積作為讀片結果。乘積為0記為（-），1～2記為（+），3～4記為（++），＞4記為（+++）。（-）為陰性表達，其他均記為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，各蛋白在腫瘤組織與正常黏膜組織間的表達差異及腫瘤組織中各指標表達與病理特征關系用χ2檢驗，腫瘤組織各指標之間的相關性用Spearmann相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9 及 TIMP-1在結直腸癌腫瘤組織及癌旁正常腸黏膜組織中的表達情況

在結直腸癌組織中，CCDC12陽性表達率為75.53%、CyclinD1陽性率為61.70%、P21陽性率為37.23%、MMP-9陽性率為82.98%、TIMP-1陽性率為58.51%，癌旁正常腸黏膜組織中CCDC12、Cyclin D1、P21、MMP-9及TIMP-1陽性率分別為19.15%、15.96%、31.91%、25.53%及34.04%。經配對 χ2檢驗，CCDC12、CyclinD1、MMP-9 及 TIMP-1 蛋白在結直腸癌組織中陽性表達率均高于癌旁正常腸黏膜組織（χ2=38.480、30.312、38.368 及 7.667，P=0.001、0.001、0.001及0.006），P21蛋白在兩種組織中差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.862，P=0.353）。見表1和圖1。

2.2 CCDC12在結直腸癌組織表達與臨床病理參數(shù)的關系

結直腸癌組織中CCDC12蛋白陽性率與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、神經血管侵犯及遠處轉移情況差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.163、1.973、1.057、4.458、2.729、0.146 及 0.132，P=0.141、0.160、0.788、0.099、0.703 及 0.716），CCDC12 蛋白陽性表達與腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移及臨床分期差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.902、5.130、9.760及4.458，P=0.015、0.024、0.002 及 0.035）。見表 2。

表1 CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白在結直腸癌組織及相應癌旁正常腸黏膜組織中的表達 （n=94，例）

圖1 CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白在結直腸癌組織中的表達 （×200）

2.3 CCDC12與CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白在結直腸癌組織中表達的相關性

經Spearman相關分析顯示，在結直腸癌組織中，CCDC12與CyclinD1、MMP-9蛋白表達呈正相關（r=0.3022 和 0.3653，P=0.003 和 0.001），CCDC12 與 P21表達呈負相關（r=-0.2886，P=0.005）。

表2 CCDC12蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系 例

3 討論

隨著我國社會發(fā)展及飲食結構的改變，近年來結直腸癌的發(fā)生率不斷升高[9]，已成為最常見的消化道惡性腫瘤之一。該病無特異性癥狀，早期易于誤診漏診。結直腸癌具有生長迅速、侵襲轉移快的特點，因而在就診時多數(shù)患者已處于進展期，治療效果不理想。目前對結直腸癌的主要治療措施包括手術、放化療及部分靶向藥物的治療[4，10]，但總體治療效果尚待進一步提高。因此，了解結直腸癌細胞的生長侵襲機制有重要的臨床價值。結直腸癌細胞的生長侵襲是多基因共同作用的結果，在該方面已有不少研究成果，但具體機制尚未完全闡明。

CCDC12基因是CCDC家族的成員之一，該家族有眾多成員，近年來研究發(fā)現(xiàn)該家族的多個成員與惡性腫瘤關系密切[5-7]。本研究顯示，在結直腸癌組織中CCDC12表達比正常腸黏膜增強，且CCDC12的陽性表達與腫瘤浸潤深度、分化情況、淋巴結轉移及TNM分期有關，本研究結果提示CCDC12可能參與結直腸癌的生長及侵襲過程，具有導致結直腸癌進展的作用。但CCDC12在腫瘤不同階段發(fā)揮的具體作用還有待進一步研究。

CyclinD1是調節(jié)細胞周期的一種重要蛋白，該蛋白可以使Rb蛋白磷酸化而失活，從而啟動細胞周期。在腫瘤組織中CyclinD1表達異常，促進腫瘤細胞的增殖，對多種腫瘤的生長具有促進作用[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌中CyclinD1表達比正常腸黏膜增強，與LI等的研究結果符合[13]。P21蛋白具有抑制腫瘤細胞增殖的功能，其主要作用在于P21能抑制周期素依賴激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）復合物的活性，從而抑制細胞周期的進展，抑制細胞分裂[14]。但本研究中P21蛋白在腫瘤與正常腸黏膜組織中表達無差異。筆者分析這可能是由于P21蛋白只在腫瘤的特定階段發(fā)揮作用，而正常組織中P21也保持一定的表達，對細胞周期發(fā)揮調控作用，因而也有一定程度表達。MMP-9是基質金屬蛋白酶家族（MMPs）的重要成員之一，具有降解細胞外基質的功能，在腫瘤細胞的侵襲遷移中有重要的促進作用。研究發(fā)現(xiàn)MMP-9在結直腸癌腫瘤組織中具有高表達現(xiàn)象[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，MMP-9在腫瘤組織中表達增強，且與腫瘤的浸潤及分期有關，提示MMP-9在結直腸癌進展中發(fā)揮重要作用。TIMP-1具有抑制MMP-9的功能，在調節(jié)腫瘤細胞的侵襲遷移過程中發(fā)揮重要作用，研究表明TIMP-1在結直腸癌腫瘤組織的表達高于癌旁組織[16]，本研究也得到相似結果。筆者分析認為在腫瘤中MMP-9表達增強會導致抑制劑TIMP-1表達也有所增強，因而腫瘤組織也出現(xiàn)TIMP-1高表達現(xiàn)象，但總的MMPs-TIMPs平衡破壞，導致腫瘤的侵襲轉移。

本結果發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌組織中CCDC12與Cyclin D1及MMP-9蛋白表達呈正相關性，而與P21表達呈負相關性，說明CCDC12蛋白與結直腸癌的生長及侵襲有關，CCDC12可能通過上調CyclinD1、MMP-9，同時下調P21的表達而調控腫瘤細胞周期、促進細胞周圍基質降解，從而使結直腸癌易于侵襲轉移。但本研究結果僅為臨床結果的分析，具體調控關系是否存在還有待深入的研究進行證實。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CCDC12蛋白在結直腸癌組織中存在表達增高現(xiàn)象且與部分病理學特征相關，說明CCDC12蛋白可能參與腫瘤的生長侵襲過程。CCDC12參與結直腸癌生長侵襲的機制可能與CCDC12與 CyclinD1、MMP-9及 P21相互調控、共同作用有關，但具體情況還應擴大研究規(guī)模、并進行體內外實驗予以證實。

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Effect of Coiled-coil domain-containing protein 12 on growth and invasion of colorectal cancer tissues*

Wei Geng,Zhi-bin Ye,Ya-nan Fan,Wei Liang,Meng-yang Zhang
(Department of Fifth General Surgery,Hebei General Hospital,Shijiazhuang,Hebei 050051,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Coiled-coil domain-containing protein 12 (CCDC12)on growth and invasion of colorectal cancer.MethodsImmunohistochemistry (IHC)was used to detect expression of CCDC12 in 94 cases of colorectal cancer and associated adjacent healthy tissues.Growth and invasion related proteins including CyclinD1, P21, nD1, P 1, matrix metall 9 (MMP-9), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1)were also determined.Biological characteristics of cancer were recorded and correlated with concentrationsofCCDC12,CyclinD1,P21,MMP-9,TIMP-1 proteins.ResultsPositive expression rates of CCDC12,CyclinD1,MMP-9 and TIMP-1 in colorectal cancer tissues were significantly increased when compared with those in healthy tissues (χ2=38.480,30.312,38.368 and 7.667,respectively)(P＜ 0.01)while no significant difference was observed in concentration of P21 in the tissues (χ2=0.862,P=0.353).Intimate correlations of CCDC12 with characters of tumor such as differentiation,depth of invasion,lymphatic metastasis,and TNM stages(χ2=5.130,5.902,9.760 and 4.458;P=0.024,0.015,0.002 and 0.035,respectively)were observed.Spearman correlation analysisshowed thatthe expression ofCCDC12 was positively correlated with Cyclin D1 and MMP-9 (r=0.302 and 0.365,P=0.003 and 0.001,respectively)while negative correlation was found between CCDC12 and P21 (r=-0.287,P=0.005).ConclusionsCCDC12 is highly expressed in colorectal cancer,which affects Cyclin D1-,P21-and MMP-9-mediated growth and metastasis of colorectal cancer.

colorectal cancer;CCDC12 gene;tumor growth;tumor invasion

R735.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.009

1005-8982（2017）24-0044-05

2017-01-10

河北省科技計劃項目（No：162777218）

（王榮兵 編輯）