HSP60與高脂飲食誘導的小鼠骨骼肌內質網應激的相關性研究

●李妍 羅玥佶 湯婷

HSP60與高脂飲食誘導的小鼠骨骼肌內質網應激的相關性研究

●李妍 羅玥佶 湯婷

目的：探討熱激蛋白60在高脂飲食誘導的胰島素抵抗小鼠骨骼肌內質網應激的表達機制。方法：4周齡C57BL/6J小鼠隨機分組為正常和高脂飲食組。高脂飲食組給予高脂飲食16周，建立胰島素抵抗小鼠模型。采用Western blot方法檢測HSP60及內質網應激因子CHOP等蛋白表達。結果：與正常飲食組比較，高脂飲食誘導胰島素抵抗小鼠體重明顯增加，葡萄糖耐量降低。骨骼肌中HSP60、CHOP、ClpP表達顯著性升高（P＜0.05）。結論：高脂飲食誘導胰島素抵抗小鼠骨骼肌中HSP60表達水平升高，這可能與內質網應激發生有關。

HSP60；內質網應激；高脂飲食；胰島素抵抗

熱休克蛋白60(Heat shock protein 60,HSP60)是一種高水平基礎表達的蛋白之一，作為一種分子伴侶，參與蛋白質折疊、裝配及成熟過程。近年來研究發現，細胞受到刺激后HSP60蛋白表達量明顯提高。在糖尿病患者血清中HSP60水平有顯著改變，可能是一個與炎癥反應相關、參與糖尿病發生發展的潛在因素。內質網（Endoplasmic reticulum, ER）是真核細胞內重要的膜性結構細胞器。在內質網應激誘導的細胞凋亡中，線粒體的改變也扮演著重要角色，即線粒體與內質網應激細胞的凋亡之間存在密切關系。本研究探討熱激蛋白60在高脂飲食誘導的胰島素抵抗小鼠骨骼肌內質網應激的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

SPF級C57BL/6J雄性小鼠4周齡14只，購自湖南斯萊克實驗動物有限公司。小鼠編號后，適應喂養3天后隨機分為兩組，對照組7只喂養正常飼料（NC），高脂組7只喂養高脂飼料（HFD）。每周統計體重，喂養16周肥胖模型建立成功后處死小鼠，收集組織標本。

1.2 葡萄糖耐量試驗（GTT）

小鼠禁食12h，斷尾取血測血糖值，按體重2mg/g行50%葡萄糖注射，于15、30、60、90、120分鐘分別測血糖。

1.3 免疫印跡檢測

提取肌肉組織總蛋白，BAC法檢測蛋白濃度，取蛋白質樣品10ug，經SDS－PAGE凝膠電泳分離，并轉膜，經與一抗HSP60、CHOP、ClpP、XBP1s、XBP1u和二抗溫育，發光試劑ECL顯色。以目的蛋白與相應內參條帶吸光度比值作為目蛋白相對表達量。選擇GAPDH為內參照。

1.4 統計學方法

所有數據采用SPSS16.0軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s ）表示。兩兩比較采用t-檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高脂飲食增加小鼠體重、降低葡萄糖耐量

與正常組比較，高脂飲食組小鼠在16周喂養后體重明顯上升，有顯著統計學差異（P＜0.05）。見表1。50%葡萄糖注射行葡萄糖耐量試驗，15、30、60、120分鐘測血糖，HFD小鼠血糖水平明顯升高，糖耐量明顯減退，差別有統計學意義（P＜0.05），見表2。高脂飲食誘導、胰島素抵抗動物模型建立成功。

表1 高脂飲食對小鼠體重的影響（g）

表1 高脂飲食對小鼠體重的影響（g）

喂養周數分組 4 8 12 14 16正常組 23.8±0.6127.75±0.9329.51±1.2229.45±1.99 30.09±2.5高脂組 25.32±1.0932.36±1.3739.04±0.9740.66±2.2142.28±2.17

表2 高脂飲食對小鼠葡萄糖耐量影響（mmol·L-1）

表2 高脂飲食對小鼠葡萄糖耐量影響（mmol·L-1）

15 30 60 120正常組 5.37±0.23 22.74±2.0917.37±2.21 9.97±1.40 7.68±0.53高脂組 10.81±0.4133.06±2.8431.46±2.4828.13±2.2013.33±0.66組別 時間（分鐘）0

2.2 高脂飲食增強HSP60及內質網應激相關分子的表達

正常飲食或高脂飲食喂養16周后，各組小鼠骨骼肌組織通過免疫印跡實驗檢測HSP60表達，正常對照組HSP60表達比HFD組顯著增加。同時，HFD組小鼠骨骼肌中內質網應激相關蛋白質CHOP、ClpP表達水平均比正常組增強，而XBP1s、 XBP1u表達無明顯變化。見圖1。

圖1 高脂飲食小鼠骨骼肌HSP60和內質網應激相關蛋白質CHOP、ClpP、XBP1s、XBP1u電泳條帶及相對密度值（?P＜0.05）

3 討論

內質網是真核細胞內重要細胞器，在受到外界條件的刺激下引發內質網應激（ERS），適應性地抑制蛋白質合成、加速蛋白降解等緩解ERS，協助細胞的自身修復。HSP60主要存在于真核細胞線粒體中，并被證實與自身免疫性等疾病發病相關。在生理狀態下，HSP60主要通過與凋亡相關因子的相互作用以及減少線粒體產生氧自由基而發揮抗凋亡效應。盡管已有研究表明，肥胖小鼠肝臟中出現氧化應激是ERS的開始的主要標志，而后引起線粒體功能異常。體外實驗表明，抑制內質網應激還可阻止細胞凋亡和肌纖維的分化，說明內質網應激可促進肌細胞形成。研究還顯示鍛煉加上飲食的改善可提高葡萄糖耐受性受損個體的HSP60和GRP75在肌肉中的表達。在本研究中，長期高脂飲食可明顯增加小鼠體重和降低葡萄糖耐量，小鼠骨骼肌中內質網應激標志物CHOP表達上調，其相關蛋白ClpP表達也上調，而XBP1及其剪切形式變化不明顯。可以認為高脂飲食引起的胰島素抵抗中HSP60與內質網應激的激活有關系。隨著對HSP60及肥胖糖尿病發病機制的進一步研究，HSP60可能成為預測糖尿病早期發生的一個新指標。

（作者單位：長沙醫學院基礎醫學院）

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羅玥佶

湖南省教育廳科研項目（湘財教[2014]85號14C0130;湘財教[2015]54號15C0154）;長沙醫學院科研項目（長醫研[2014]2號-KY201442）