高效液相色譜法在二活雙烏通絡止痛濕敷劑芍藥苷含量測定中的應用

劉俊波

(許昌市食品藥品檢驗檢測中心 質保室 河南 許昌 461000)

·藥學·

高效液相色譜法在二活雙烏通絡止痛濕敷劑芍藥苷含量測定中的應用

劉俊波

(許昌市食品藥品檢驗檢測中心 質保室 河南 許昌 461000)

目的摸索、建立并確立二活雙烏通絡止痛濕敷劑中芍藥苷的含量測定方法。方法采用高效液相色譜法(NP-HPLC)測定二活雙烏通絡止痛濕敷劑的芍藥苷含量。結果以LC-10VP高效液相色譜儀、LC-10SPD紫外檢測器、VP-ODS(5 μm，150 mm×4.6 mm ID)色譜柱、N2000色譜工作站、流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(15∶85)、流速：1 ml/min、柱溫：室溫、檢測波長：230 nm；理論塔板數按芍藥苷峰計算應不低于3 000，對照品、樣品得以良好分離，標準曲線方程Y=35 685.612 15X+711 470.638 50，r=0.999 232 9，芍藥苷在0.200～0.800 μg范圍內，芍藥苷峰面積值與進樣量有良好的線性關系。結論根據上述10批樣品測定結果，暫定本品每貼含赤芍以芍藥苷(C23H28O11)計，不得少于1.00 mg。經對以上10批樣品中芍藥苷的含量進行測定表明，本項研究確能控制和評判產品質量，其操作簡便、滿足質量控制要求。

高效液相色譜法；二活雙烏通絡止痛濕敷劑；芍藥苷

痹證是指一種因風、寒、濕等病邪侵襲人體肌表，經絡致氣血凝滯、閉阻不暢的病證。臨床特點是肢體、肌肉、關節等處疼痛、酸楚、麻木、重著、屈伸不利或關節腫脹等癥狀。痹癥出自《內經》，并對其病因、病機、癥狀等均有較詳細的論述，同時根據其不同發病季節、病因及經絡和臟腑等而又提出各種不同的病證。如 《素問·痹論》說:“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也?！薄讹L濕痹候》說：風濕痹“由血氣虛則受風濕，而成此病。”《素問·痹論》：“風、寒、濕三氣雜到，合而為痹也”。病因在于經久勞損，風寒濕邪入侵相搏，痰阻經絡而致經絡不通，氣血痹阻，痹在于骨則重而不舉，在于脈則血凝不流，在于筋則屈伸不利”。肩周炎、風濕性關節炎、頸椎病等多屬痹癥的范疇，臨床癥候以肢體疼痛、活動受限、困重無力、麻木僵硬為其特點。解除這些癥狀，需要采取祛風除濕、舒筋止痛、活血化瘀的方法予以治療。

取方于民間驗方的二活雙烏通絡止痛濕敷劑以“祛風、活絡、止痛”的“防風、羌活、獨活”為君藥，以“溫通經脈、活血化瘀、通絡止痛”的“白芷、桂枝、制川烏、制草烏、赤芍、肉桂”為臣，并佐使以“紅花、透骨草、千年健、伸筋草、川牛膝、川芎”等，具有 “祛風散寒止痛，活血化瘀通絡”功效，對風、寒、濕、血瘀引起的肩周炎、風濕性關節炎、肩關節周圍軟組織疼痛，麻木，屈伸不利及頸椎病等有良好治療效果。

根據本品處方組成，為有效控制產品內在質量，選擇處方中具有清熱涼血、散瘀止痛的傷科良藥-赤芍的活性成分芍藥苷作為控制本品質量的指標。本標準參考有關文獻資料，采用高效液相色譜法(NP-HPLC)測定芍藥苷含量，建立起可迅速測定本品中芍藥苷含量的方法，本法具有分離效果好、靈敏、準確度高等優點。

1 儀器與試藥

1.1儀器LC-10VP高效液相色譜儀(日本島津SHIMADZU公司)；LC-10SPD紫外檢測器(日本島津SHIMADZU公司)；VP-ODS(5 μm，150 mm×4.6 mm ID)色譜柱(日本島津SHIMADZU公司)；N2000色譜工作站(浙江大學軟件開發公司)；塞多利斯BP211D電子天平(德國)；AS 3120A超聲波清洗器(Automatic Science(Tianjing)Instrument Co.Ltd)。

1.2試藥芍藥苷對照品(批號110749-200512，供含測用，由中國藥品生物制品檢定所提供)；乙腈為色譜純試劑(美國TEDIA公司)；水為二次蒸餾水；其余試劑為分析純(西安化學試劑廠)。

2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：VP- ODS柱(5 μm，150 mm×4.6 mm ID)；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(15∶85)；流速：1 ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：230 nm；理論塔板數按芍藥苷峰計算應不低于3 000。見表2。

按照上述色譜條件，分別注入對照品、供試品、陰性樣品溶液，其色譜圖分別為圖1、圖2、圖3，從對色譜分離的效果分析表(表1、表2、表3)可見，理論塔板數按芍藥苷峰計算遠大于3 000，且供試品色譜中，芍藥苷峰型規整，實現了良好的分離，表明色譜條件與系統均適用。

圖1 對照品色譜圖

峰號峰名保留時間峰面積含量13.065806.7880.153202芍藥苷17.248525817.23399.84688總計526624.021100.00000

表2 系統評價表

圖2 樣品色譜圖

峰名保留時間峰面積理論塔板數分離度拖尾因子不對稱度芍藥苷16.785373856.000100118.6262.3701.0351.046

圖3 缺芍藥苷陰性色譜圖

3 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對照品10 mg，置25 ml量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 ml含芍藥苷40 μg)。

4 供試品溶液的制備

4.1提取完全性試驗取本品5貼(批號20150601)，擠干，無紡布用水洗滌4次，每次10 ml，分別收集擠出液與各次洗滌液于水浴鍋上蒸干，殘渣用50%甲醇適量溶解并轉移至10 ml已精密稱定的量瓶中，再分別用50%甲醇稀釋至刻度，精密稱定，搖勻，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，分別精密吸取對照品溶液及各次洗滌液供試品溶液各10 μl測定芍藥苷含量。見表4。

表4 提取完全性試驗

上述結果表明，第4次洗滌液中芍藥苷含量已微乎其微，第3次洗滌液中芍藥苷含量略有痕量，為簡化操作節約時間可采用洗滌2次，每次10 ml，擠出液與2次洗滌液合并，置于50 ml已精密稱定的量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，精密稱定，搖勻，精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇并稀釋至刻度以定容。

4.2制備方法的選擇取本品5貼，擠干，無紡布用水洗滌2次，每次10 ml，擠出液與2次洗滌液合并，置于50 ml已精密稱定的量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，精密稱定，搖勻，精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。

5 線性關系考察

精密稱取芍藥苷對照品10 mg，置250 ml量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻(40 μg/ml)，分別精密吸取對照品溶液5.0、10.0、12.5、15.0、20.0 μl進樣，測定峰面積值。見表5。

以峰面積值(Y)對進樣量(X)進行回歸，得標準曲線方程Y=35 685.612 15X+711 470.638 50，r=0.999 232 9。以峰面積值(Y)對進樣量(X)作圖，得一直線(見圖4)。

表5 標準曲線試驗結果

圖4 芍藥苷標準曲線

以上結果表明,在0.200～0.800 μg范圍內,芍藥苷峰面積值與進樣量有良好的線性關系。

6 精密度考察

按所選定的對照品溶液的制備方法，制備對照品溶液，重復進樣5次，每次20 μl，測定芍藥苷峰面積值。見表6。結果平均峰面積為594 683.742，SD=2 929.957，RSD=0.492 7%，表明精密度良好。

表6 精密度測定結果

7 穩定性考察

按所選定的供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，分別在0、1.5、3、4.5、6 h進樣，測定供試品溶液中芍藥苷峰面積。見表7。結果平均峰面積為369 726.043 8，SD=6 177.847，RSD=1.67%，結果表明樣品在6 h內穩定性良好。

表7 穩定性試驗結果

8 重現性考察

按擬定的含量測定方法，取同一批樣品(批號150601)5份，分別按照供試品溶液的制法制備供試液，按擬定的色譜條件測定芍藥苷的含量，結果見表8。結果芍藥苷的平均含量為1.459 8mg/貼，SD=0.015 512 8，RSD=1.07%，表明重現性良好。

表8 重現性試驗結果

9 干擾性試驗

按本制劑處方組成，制備不含赤芍的陰性空白制劑，按擬定的樣品制備方法，制得陰性對照溶液，將對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液分別進樣。結果陰性對照溶液在芍藥苷色譜峰處無相應峰出現(見圖3)，而供試品溶液在芍藥苷峰處有峰出現(見圖2)，說明處方中其余藥味對芍藥苷的測定無干擾。

10 回收率試驗

取已知含量的樣品(批號150601含量：1.46 mg/貼)24貼，其中12貼平均分作6份，另12貼平均分作4份。

取以上10份樣品，除去包裝，擠干，無紡布用水洗滌2次，每次10 ml，擠出液與2次洗滌液合并，置于50 ml已精密稱定的量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，精密稱定，搖勻，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，分別在其中精密加入濃度為40 μg/ml芍藥苷對照品溶液3 ml、3 ml、3 ml、10 ml、10 ml、10 ml、3 ml、3 ml、10 ml、10 ml，加50%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，測定芍藥苷的含量以下列公式計算回收率。見表9。結果表明，平均回收率為100.08%，SD=1.43，RSD=1.43%，加樣回收率良好。

表9 回收率試驗結果

11 樣品測定

按上述方法測定中試生產樣品中芍藥苷的含量。見表10。

表10 中試樣品中芍藥苷含量測定結果

根據上述10批樣品測定結果,暫定本品每貼含赤芍以芍藥苷(C23H28O11)計,不得少于1.00 mg。

12 結果與討論

本品為濕敷劑，系由無紡布等吸附載體吸收適量液體而成，由于吸附載體的引入，導致在定量取樣時不如固體或液體制劑方便，而類似于軟膏劑等，故采用獨立單體進行取樣，尤在回收率試驗中使用不同劑量以考察數據偏差而評價試驗系統誤差。在供試品制備中，使用先定容濃配再定容稀配的處理樣品方式以控制和降低試驗系統誤差。

經對以上10批樣品中芍藥苷的含量進行測定表明，本項研究確能控制和評判產品質量，其操作簡便、滿足質量控制要求。

R 284

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.20.022

2016-12-28)